免疫印跡(Western blot)簡介和原理

        免疫印跡用于鑒定能夠與特異性抗體相互作用的大分子抗原（一般為蛋白質）并測定抗原的大小。蛋白質首先通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再通過電泳轉移到固相支持物上，固相支持物包括硝酸纖維素膜，聚偏乙烯二氟（PVDF）膜和陽離子尼龍膜等。首先把膜上未反應的位點封閉起來以抑制抗體的非特異性吸附，這樣固定的蛋白即可與特異性的多克隆或單克隆抗體相互作用。最后通過放射，生色或化學發光的方法進行定位。

實驗常規試劑

1.  1.0 mol/L Tris•HCl （pH6.8）

2.  1.5 mol/L Tris•HCl（pH8.8）

3.  10% SDS

4.  10% 過硫酸胺（AP）

7.  還原型 5XSDS 上樣緩沖液

8.  10X電泳液緩沖液

9.  10X轉膜緩沖液

10. 1X轉膜緩沖液

11. 10XTBS緩沖液

12. 1XTBST緩沖液

13. 封閉緩沖液: 1X TBST 含5% w/v 脫脂牛奶或者1X TBST 含2%-5%的牛血清白蛋白(BSA)。

14. 一抗/二抗稀釋緩沖液: 常規稀釋液使用的是含5% BSA 或5%脫脂牛奶的1X TBST，見一抗/二抗說明書；每種Elabscience®抗體都有固定的最佳稀釋比例。

操作步驟

1.     根據待測蛋白分子量大小確定凝膠（分離膠）濃度制膠

2.    上樣 使用適當的裂解液以及裂解方法裂解貼壁細胞、懸浮細胞或者組織樣品。

3.     跑膠： 濃縮膠推薦用 80 伏電壓，待樣品進入分離膠后，可用 120-180 伏。

4.     跑膠完成以后，需先將膠上無樣品的多余部分切除，濾紙和海綿需要預先潤濕。

5.     分離的多肽轉移至膜載體上

        選擇合適的膜

        轉膜：以NC膜為例

        提前十分鐘到半小時用轉膜 Buffer 潤洗 NC 膜

        按照以下的結構來安裝轉膜體系：負極-海綿-三層濾紙-膠-膜-兩層濾紙-海綿-負極。

6.     轉膜，一般為 2 小時。

7.     轉完后將膜用1×麗春紅染液染5 min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。 將膜晾干備用。

8.     抗原檢測

        免疫印跡膜上非特異性蛋白質結合位點的封閉：

        a. 轉好的膜先用 TBST 潤洗兩次，每次五分鐘。低速水平搖床，常溫。

        b. 用 5%的脫脂牛奶（TBST 配制）常溫封閉一至兩小時。封閉過程應在常溫下置于轉速較低的水平搖床。

        抗體與抗原特異性結合：一抗孵育

9-11.用 TBST 洗膜三次，每次十分鐘。

12.   常溫下用二抗孵育一到兩個小時。

13-15. 用 TBST 洗膜三次，每次十分鐘。

16.    準備 ECL 底物，對 8×5 cm 的膜，2毫升（1 毫升 A 加1 毫升 B）足夠。將膜浸潤底物中 1 分鐘，然后取出，用濾紙吸掉膜上多余的底物。

17.    用 x-ray 底片曝光，根據信號的強弱適當調整曝光時間，一般為1 min或5 min，也可選擇不同時間多次壓片，以達最佳效果；曝光完成后，打開X-光片夾，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現明顯條帶后，即刻終止顯影。

Western blot常見問題分析指南

為什么電泳的條帶很粗？

        電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。

        處理辦法：適當增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的pH正確(6.7）；適當降低電壓；

為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？

       這種現象一般初學者易出現。比如電壓50v以上，可電流卻在5mA以下。主要是由于電泳槽沒有正確裝配，電流未形成通路。包括：a.內外槽裝反；b.外槽液過少；c.電泳槽底部的絕緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）。

       處理辦法：電泳槽正確裝配即可。