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石蠟切片免疫組化實驗步驟

瀏覽次數(shù):3661 發(fā)布日期:2018-7-3  來源:www.elabscience.cn

脫蠟和水化

1.   將切片依次浸入二甲苯Ⅰ10 min,二甲苯Ⅱ(10 min)。

2.   再次浸入無水乙醇Ⅰ(5 min)-無水乙醇Ⅱ(5 min)-95%酒精(5 min)-80%酒精(5 min)-70%酒精(5 min),然后去離子水沖洗2次,每次2 min。

 

抗原修復 (可選)

3.   將組織切片放入修復盒,然后加入適量0.01M枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)或EDTA修復液(pH 9.0),液面要浸沒組織。

4.   微波中檔修復10 min(液體沸騰時開始計時),此過程中勿使組織干片。

5.   將修復盒從微波爐中拿出,自然冷卻降溫,當修復液降至室溫后取出玻片,PBS(pH 7.4)沖洗3遍,每次3 min(沖洗過程中切勿對著組織沖洗,以免弄破組織)。

 

滅活

6.   將配制好的3%的過氧化氫(去離子水稀釋30%過氧化氫)滴加于切片組織上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,室溫孵育15 min,PBS沖洗3次,每次3 min。

 

抗體孵育

7.   吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加5%的正常血清(與二抗種屬來源一致或相似),37℃封閉30 min。

8.   用吸水紙擦干玻片組織周圍的液體,用油性筆在組織周圍畫圈,然后滴加稀釋好的一抗,如果做陰性對照實驗,就在對照組的組織上滴加PBS。加完一抗后于4 °C濕盒中孵育過夜。(抗體的最佳稀釋比應預先通過實驗確定,時間控制在15h以上)。

9.   PBS 沖洗切片3次,每次3 min,吸水紙擦干切片后滴加辣根過氧化物酶標記二抗 ,37 ℃孵育30 min。

 

信號檢測

10.   PBS沖洗切片4次,每次3 min,甩去PBS液體后吸水紙擦干切片,每張切片滴加新鮮配制的DAB顯色液,顯微鏡下觀察,陽性信號為棕黃色或棕褐色,時間要控制好,切勿顯色過深。用自來水沖洗切片終止顯色。

11.   Harris蘇木素復染,一般30 s-1 min左右,水洗后用1%的鹽酸酒精分化,再用自來水沖洗返藍。(染核,可選)

 

脫水固定封片

  1.   將切片置于水中沖洗后,將切片依次放入:70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-無水乙醇Ⅰ-無水乙醇Ⅱ-二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ中脫水透明,每個試劑中放置2 min,最后在通風櫥中風干切片。
  2.   將中性樹膠滴在組織旁邊,再用蓋玻片蓋上。先放平一側(cè),然后輕輕放下另一側(cè),以免產(chǎn)生氣泡,封好的切片平躺置于通風櫥中晾干。
  3.   晾干的切片可以在顯微鏡下觀察或采集圖像。
發(fā)布者:武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司
聯(lián)系電話:400-999-2100
E-mail:marketing@elabscience.cn

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