實驗原理：

利用哺乳動物系統(tǒng)生產(chǎn)蛋白的方式有兩種：瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選。通過穩(wěn)定細胞系構(gòu)建篩選穩(wěn)定表達細胞株。針對瞬時轉(zhuǎn)染，外源基因在短時間轉(zhuǎn)錄翻譯得到的蛋白量較少，能夠滿足小量蛋白制備，大量生產(chǎn)成本很高。相對于此，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的是將外源基因整合到細胞自身的基因組上，隨著細胞的生長分裂外源基因可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達，同時經(jīng)過抗生素加壓篩選，最終得到能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達蛋白的細胞株，穩(wěn)轉(zhuǎn)株生產(chǎn)蛋白穩(wěn)定性更好，批次差異性更小。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的應(yīng)用

影響穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的因素

1、外源基因整合的幾率

決定了穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選的簡易程度，有利于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的獲得；

2、插入外源基因片段的拷貝數(shù)

一般情況下，低拷貝或者單拷貝可以降低人為因素的干擾；

3、整合位點轉(zhuǎn)錄活躍度

整合位點轉(zhuǎn)錄活躍度決定了穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選細胞后穩(wěn)轉(zhuǎn)株中外源基因片段的表達質(zhì)量；

4、外源基因片段整合到細胞后的穩(wěn)定性

不同的整合位點決定了外源片段在染色體中的穩(wěn)定性，有些區(qū)域易發(fā)生重組或者丟失，從而使穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選后出現(xiàn)丟失的現(xiàn)象。

制備穩(wěn)轉(zhuǎn)株的實驗步驟

一．準備及預(yù)實驗

1、確定細胞系相關(guān)信息：需包括如下內(nèi)容

注：務(wù)必保證細胞無支原體污染，方可進行穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建！

2、查閱慢病毒感染該細胞的MOI值

3、預(yù)實驗確定篩選藥物用量：

（1）查閱Puromycin/Blastincidin在目的細胞中穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選的致死用量信息；參考查閱得到的數(shù)據(jù)，確定3個藥物濃度梯度（如沒有相關(guān)信息，則需將藥物濃度梯度范圍增大，數(shù)量增多至6個）；

（2）D0將細胞鋪于6孔板中，使D1細胞融合度約90%；D1按（1）中設(shè)置的藥物梯度，加入藥物；

（3）D4換液，并重新加入藥物；

（4）D7觀察，找到致死率100%的孔，該孔使用的藥物濃度，即為藥物篩選濃度。

二．穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選及構(gòu)建

注：以下實驗參數(shù)，按1株穩(wěn)轉(zhuǎn)株為例描述，實驗需考慮有無對照穩(wěn)轉(zhuǎn)株！

1、細胞鋪板：D0將細胞接種于6孔板中（4個孔），使D1細胞融合度約70%

病毒感染：

2、慢病毒上清：分別棄去6孔板中3個孔的0.5毫升培養(yǎng)基、1毫升培養(yǎng)基、2毫升培養(yǎng)基和，分別加入2毫升慢病毒上清、1.5毫升慢病毒上清和0.5毫升慢病毒上清；

3、純化慢病毒：選3個孔，并可按推薦MOI、大于此MOI及小于此MOI，共三個MOI值，添加慢病毒；

4、觀察感染效率：感染后72小時，觀察感染效率，效率高于80%最佳，最低不應(yīng)低于40%，選擇1-2個感染效率較好的孔。

5、篩選：

(1)多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株：從感染72小時后開始于6孔板中加篩選藥物，每隔2天，重新?lián)Q液加入藥物。藥物篩選需至少持續(xù)14天，直至顯微鏡下觀察熒光細胞比例為100%。

注：第一次加入藥物時在上午進行，4-6小時后觀察細胞狀態(tài)，如細胞死亡過多，需更換新鮮不含藥物的培養(yǎng)基。

(2)單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株：建立在獲得多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株基礎(chǔ)上。

A、有限稀釋法：

a.取24個1.5毫升EP管，每管中加入800毫升完全培養(yǎng)基；

b.用胰酶將多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株消化（90%融合度，10毫升培養(yǎng)基終止消化），取80微升至第一個EP管中，混合均勻；

注：應(yīng)使用1000微升槍尖，混合時不要過度吸打，以免破壞細胞。

c.從第一個EP管中取80微升至第二個EP管中，混合均勻，以此類推。

d.將EP管中的細胞懸液，以每孔100微升，接種于96孔板中；

e.過夜培養(yǎng)后，觀察第12-24列，尋找只含有1個細胞的孔，并做好標記；

f.培養(yǎng)3-4周，待標記孔中細胞擴增后，消化傳代擴增，即為單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞。

注：培養(yǎng)的第一周不要換液，接下來每3-4天換液。

B、平板挑取法

a.計數(shù)100個多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞，接種于一個10cm培養(yǎng)盤中；

注：盡量吹打均勻，防止細胞聚團。

b.過夜培養(yǎng)后，觀察并尋找單個細胞的位置，并在盤底做標記；

c.培養(yǎng)2周；

注：培養(yǎng)的第一周不要換液，接下來每3-4天換液。

d.待標記處的細胞擴增為肉眼可見的白點，使用10微升移液器，調(diào)至最大量程，在尖端吸取一點胰酶（約5微升，且尖端為空氣），緩慢滴至白點處，保持槍尖靜置在白點上，且不讓胰酶留出白點所在范圍，1min后，迅速吹打，將消化下的細胞轉(zhuǎn)移至96孔板中，傳代擴增，即為單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞。約需2-3周。

注：每盤選取20個為宜，在消化時，需按照先消化邊緣的，再消化中心的原則，防止克隆之前的相互污染。培養(yǎng)的第一周不要換液，接下來每3-4天換液。

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