儀器、設備：

    移液器、免疫組化筆、微波爐或高壓鍋、計時器、孵育濕盒、染色架、蓋玻片、光學顯微鏡、洗瓶等。

溶液配制：

    PBS溶液配制；EDTA組織抗原修復液及DAB顯色液使用詳見免疫組化試劑盒產品說明書操作步驟。

實驗溫度：15-28℃

實驗步驟：

1. 脫蠟水化

    1) 石蠟切片置于新鮮的二甲苯中，浸泡15 min × 2次；

    2) 去除多余的液體后，置無水乙醇中，浸泡3 min × 2次；

    3) 去除多余的液體后，置95%乙醇中，浸泡3 min；

    4) 去除多余的液體后，置85%乙醇中，浸泡3 min；

    5) 自來水沖洗1 min；

    6) PBS溶液沖洗3 min × 3次。

2. 加熱EDTA抗原修復液（試劑1，采用微波進行抗原修復）

    1) 將脫蠟水化后的組織切片置于燒杯（或修復盒）中的耐高溫塑料切片架上；

    2) 加適量的修復液1x EDTA抗原修復液，（溶液1，用純凈水稀釋20倍后）于燒杯中，液面要浸過切片組織一定高度；

    3) 微波爐先用高檔加熱使液體沸騰，當加熱至沸騰時調到中檔，此時開始計時，修復時間一般為20 min，此過程中勿使組織干片（修復液要足量）；

    4) 將燒杯從微波爐中拿出，放入冷水中冷卻降溫；

    5) 當修復液降至室溫后取出玻片，用PBS（PH7.4）沖洗3 min × 3次。

    注意：

    抗原修復時，修復液務必保證切片始終浸泡在液體內，一般情況：修復液的量為800 mL/1架-1500 mL/3架；

    取出玻片，用PBS沖洗時，切勿對著組織沖洗，以免弄破組織。

3. 阻斷內源性過氧化物酶

    1) 用吸水紙擦干玻片，免疫組畫筆在組織周圍畫圈；

    2) 將3%的過氧化氫（試劑2），滴加100 μL到切片組織上以阻斷內源性過氧化物酶，室溫孵育15 min；

    3) PBS沖洗3 min × 3次。

4. 封閉

    用吸水紙擦干玻片，滴加正常山羊血清（試劑3），室溫封閉15 min，以減少非特異性染色。

5. 一抗孵育

    1) 用吸水紙擦干玻片組織周圍的液體；

    2) 滴加單克隆抗體（試劑4）100 μL，如果做陰性對照實驗，就在對照組的組織上滴加PBS作為陰性對照，置于濕盒中室溫孵育1h或4°C孵育過夜。

6. 復溫

    1) 樣本4℃過夜從冰箱拿出后需在室溫下孵育15 min復溫（抗體孵育為4℃過夜選用此步驟，如室溫孵育直接進入下一步清洗）；

    2) PBS沖洗3 min × 3次。

7. 加聚合物輔助劑（試劑5）

    1) 吸水紙擦干切片后滴加試劑5（Polymer Helper），室溫或37℃孵育20 min；

    2) PBS沖洗3 min ×3次。

8. 二抗孵育

    1) 吸水紙擦干切片后滴加試劑6（Polyperoxidase-anti-mouse/rabbit IgG），室溫或37℃孵育20 min；

    2) PBS沖洗3 min × 4次。

9. 顯色

    1) 甩去PBS液，吸水紙擦干切片；

    2) 每張切片滴加新鮮配制的DAB顯色液100 μL（試劑7：試劑8=1:49比例配置），孵育3-5 min，光學顯微鏡下觀察染色結果，切勿顯色過深；

    3) 顯色后用自來水沖洗切片終止顯色。

10. 復染

    加100 μL的蘇木素（試劑9）復染，孵育30 s-1 min左右，自來水沖洗5 min。

    注意：

    依據作用的蘇木素染色液強度和孵育時間長短，對比染色結果導致細胞核呈現淡藍到深藍顏色的反應，而過染或者不足都可能影響正確結果的判斷。

11. 脫水、透明、封片

    1) 將切片放入70%酒精，浸泡2 min；

    2) 將切片放入80%酒精，浸泡2 min；

    3) 將切片放入90%酒精，浸泡2 min；

    4) 將切片放入95%酒精，浸泡2 min；

    5) 將切片放入無水乙醇，浸泡2 min × 2次；

    6) 將切片放入二甲苯，浸泡2min × 2次；

    7) 通風櫥中風干切片；

    8) 滴加中性樹膠，蓋玻片封片。

結果判斷：
1. 免疫組化檢測結果需在光學顯微鏡下對染色后的切片進行觀察并判斷。

    免疫組化染色結果必須建立在組織陽性對照、試劑陰性對照試驗成立的基礎上，染色結果的判讀：陽性（+）/陰性（—）。

陰性染色結果是組織內預期細胞中未見棕黃色著色。

    注意：在每一次染色過程中，必須使用陽性對照樣本和空白對照試驗，否則結果不可采用。

2. 組織陽性對照和試劑陰性對照試驗成立的基礎上，受檢組織切片中出現陽性染色表示組織切片上存有目的抗原。

3. 組織陽性對照和試劑陰性對照試驗成立的基礎上，受檢組織切片中未出現陽性染色表示組織切片上存有目的抗原的可能性低。

4. 如果組織陽性對照和試劑陰性對照試驗均為陰性結果，表明試劑失效或試驗操作錯誤，應重新實驗。