IHC原理、操作及注意事項
免疫組織化學（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細胞內抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及定量的一項技術。
IHC的實驗流程和方法總體不難，但做出漂亮的染色結果卻不容易，所謂“細節決定成敗”，也正是IHC實驗中尤為重要的關鍵點。那么“細節”主要是哪一些呢？下面就為您一一道來。（以石蠟組織切片為例介紹）
1. 標本固定
固定的目的除了使細胞內的蛋白質凝固，減少或終止內源性或外源性細胞內分解酶的反應，防止組織細胞自溶，更是為了保存組織或細胞內的抗原性，使抗原不失活，不發生彌散。不同的抗原對固定液耐受程度不同，因而要選擇合適的固定劑。
現在常用的固定劑有中性甲醛液，4%多聚甲醛-磷酸鹽緩沖液。有些固定劑對特殊組織有更好效果，如苦味酸對于頭皮、指甲固定有軟化效果，Helly固定液對于胰島和垂體效果較好，PLP固定液對于含糖組織抗原保存更好。
2. 脫水、石蠟包埋和制片
脫水用梯度乙醇(由低到高)充分脫水，對于一些易脆的組織（如肝、脾等）應減少高濃度酒精里的停留時間，透明的時間也應該控制縮短。對組織浸蠟時，一般選用56℃~58℃熔點的石蠟，浸蠟溫度最好不超過60℃，防止抗原的損失。包埋時應選好角度動作迅速，以便切片時有完整的切面。切片時則要該快則快該慢則慢，及時檢查刀片是否出現缺口，防止蠟帶出現劃痕。
3. 脫蠟和水化
使組織恢復到固定后的正常狀態暴露出抗原以方便與一抗結合。若脫蠟和水化不全易出現局灶性反應和浸洗不全，而產生非特異性背景著色。
4. 抗原修復
由于組織在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發生了蛋白之間交聯及醛基的封閉作用，從而掩蓋抗原決定簇。通過抗原修復，使得細胞內抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測率。常用的修復方法從強到弱一般分為三種，高壓加熱修復、微波修復、胰酶修復。其中高壓加熱修復這一方法簡便易操作，效果也更好。使用高壓加熱修復對于修復溫度和時間的把握十分重要，溫度越高修復時間越短，溫度與修復時間呈負相關。修復結束后注意室溫冷卻，讓蛋白自然復性。其次，盡量使用過量的抗原修復液，防止高溫液體揮發干涸，對切片造成不可逆的損傷。
5. 滅活內源性過氧化物酶和生物素
在傳統的ABC法和SP法中，免疫組化反應容易受到內源性過氧化物酶和生物素的干擾，必須用過氧化氫和卵白素等進行滅活和封閉。滅活內源性過氧化物酶一般用3%過氧化氫滅活約10 min左右，用甲醇配制過氧化氫更適合于保護抗原和固定組織。
6. 血清封閉
為了防止一抗與組織的非特異性結合，造成假陽性，一般會采用BSA、羊血清等封閉這些位點，封閉血清一般是和二抗同一動物來源的，室溫封閉10-30 min。
7. 一抗和二抗濃度和孵育時間
不同的一抗濃度，孵育時間和溫度等對染色結果往往有著較大的影響。在4 ℃下，反應緩慢，背景較淺；而37 ℃反應較快，時間較短；室溫介于前兩者之間，選擇室溫孵育有助于實驗流程的便利，同時也適用于較多樣本的檢測。二抗一般室溫孵育30 min。
8. 切片清洗(浸洗、沖洗和漂洗)
為了防止一抗、二抗等殘留而引起非特異性染色，適當地加強清洗尤其重要，建議使用洗瓶沖洗 30 s X 3 次，而一抗孵育后可用TBST單獨清洗。清洗中要注意單獨沖洗，防止交叉反應造成污染，同時溫和沖洗，防止脫片。TBS的pH和離子濃度建議用為7.6-8.0，濃度是0.01 M。中性及弱堿性條件有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解。
9. DAB顯色
背景的深淺和特異性染色的深淺都可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現特異性染色較強而背景著色較淺時即可沖洗。DAB顯色時間很短(如幾秒或幾十秒)就出現很深的棕褐色，這很可能說明一抗濃度過高，需要下調抗體濃度；若很短時間就出現深背景，有可能非特異性蛋白封閉不全，需要延長封閉時間；DAB顯色時間很長(如超過十分鐘)才出現陽性染色，可能是一抗體濃度過低或者封閉時間過長。對于較弱的DAB顏色有時可以采取增強方法。如加入金屬離子：硫酸銅、六亞甲基胺銀、氯化鈷、硫酸鎳銨、氯化鎳及咪唑等。
10. 復染
免疫組化染色后必須進行復染，以襯托出組織形態結構。目前常用Mayer's蘇木素復染，一般2 min分鐘左右，DAB在核蛋白著色則可適當縮短復染時間，然后氨水或 pH 8.0的TBS返藍。
11. 封片
為了持久保存，通常會使用中性樹膠等封片。封片過程中注意斜靠蓋玻片防止氣泡產生影響觀察。如果樹膠較粘稠可以加入適量二甲苯稀釋，使樹膠在封片中能夠快速擴散開。在脫水過后建議采取濕封，即組織上還殘留二甲苯時進行封片，同時注意在通風廚中操作。這樣有助于氣泡排除干凈，不影響后續鏡檢。
1. 標本固定
固定的目的除了使細胞內的蛋白質凝固，減少或終止內源性或外源性細胞內分解酶的反應，防止組織細胞自溶，更是為了保存組織或細胞內的抗原性，使抗原不失活，不發生彌散。不同的抗原對固定液耐受程度不同，因而要選擇合適的固定劑。
現在常用的固定劑有中性甲醛液，4%多聚甲醛-磷酸鹽緩沖液。有些固定劑對特殊組織有更好效果，如苦味酸對于頭皮、指甲固定有軟化效果，Helly固定液對于胰島和垂體效果較好，PLP固定液對于含糖組織抗原保存更好。
2. 脫水、石蠟包埋和制片
脫水用梯度乙醇(由低到高)充分脫水，對于一些易脆的組織（如肝、脾等）應減少高濃度酒精里的停留時間，透明的時間也應該控制縮短。對組織浸蠟時，一般選用56℃~58℃熔點的石蠟，浸蠟溫度最好不超過60℃，防止抗原的損失。包埋時應選好角度動作迅速，以便切片時有完整的切面。切片時則要該快則快該慢則慢，及時檢查刀片是否出現缺口，防止蠟帶出現劃痕。
3. 脫蠟和水化
使組織恢復到固定后的正常狀態暴露出抗原以方便與一抗結合。若脫蠟和水化不全易出現局灶性反應和浸洗不全，而產生非特異性背景著色。
4. 抗原修復
由于組織在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發生了蛋白之間交聯及醛基的封閉作用，從而掩蓋抗原決定簇。通過抗原修復，使得細胞內抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測率。常用的修復方法從強到弱一般分為三種，高壓加熱修復、微波修復、胰酶修復。其中高壓加熱修復這一方法簡便易操作，效果也更好。使用高壓加熱修復對于修復溫度和時間的把握十分重要，溫度越高修復時間越短，溫度與修復時間呈負相關。修復結束后注意室溫冷卻，讓蛋白自然復性。其次，盡量使用過量的抗原修復液，防止高溫液體揮發干涸，對切片造成不可逆的損傷。
5. 滅活內源性過氧化物酶和生物素
在傳統的ABC法和SP法中，免疫組化反應容易受到內源性過氧化物酶和生物素的干擾，必須用過氧化氫和卵白素等進行滅活和封閉。滅活內源性過氧化物酶一般用3%過氧化氫滅活約10 min左右，用甲醇配制過氧化氫更適合于保護抗原和固定組織。
6. 血清封閉
為了防止一抗與組織的非特異性結合，造成假陽性，一般會采用BSA、羊血清等封閉這些位點，封閉血清一般是和二抗同一動物來源的，室溫封閉10-30 min。
7. 一抗和二抗濃度和孵育時間
不同的一抗濃度，孵育時間和溫度等對染色結果往往有著較大的影響。在4 ℃下，反應緩慢，背景較淺；而37 ℃反應較快，時間較短；室溫介于前兩者之間，選擇室溫孵育有助于實驗流程的便利，同時也適用于較多樣本的檢測。二抗一般室溫孵育30 min。
8. 切片清洗(浸洗、沖洗和漂洗)
為了防止一抗、二抗等殘留而引起非特異性染色，適當地加強清洗尤其重要，建議使用洗瓶沖洗 30 s X 3 次，而一抗孵育后可用TBST單獨清洗。清洗中要注意單獨沖洗，防止交叉反應造成污染，同時溫和沖洗，防止脫片。TBS的pH和離子濃度建議用為7.6-8.0，濃度是0.01 M。中性及弱堿性條件有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解。
9. DAB顯色
背景的深淺和特異性染色的深淺都可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現特異性染色較強而背景著色較淺時即可沖洗。DAB顯色時間很短(如幾秒或幾十秒)就出現很深的棕褐色，這很可能說明一抗濃度過高，需要下調抗體濃度；若很短時間就出現深背景，有可能非特異性蛋白封閉不全，需要延長封閉時間；DAB顯色時間很長(如超過十分鐘)才出現陽性染色，可能是一抗體濃度過低或者封閉時間過長。對于較弱的DAB顏色有時可以采取增強方法。如加入金屬離子：硫酸銅、六亞甲基胺銀、氯化鈷、硫酸鎳銨、氯化鎳及咪唑等。
10. 復染
免疫組化染色后必須進行復染，以襯托出組織形態結構。目前常用Mayer's蘇木素復染，一般2 min分鐘左右，DAB在核蛋白著色則可適當縮短復染時間，然后氨水或 pH 8.0的TBS返藍。
11. 封片
為了持久保存，通常會使用中性樹膠等封片。封片過程中注意斜靠蓋玻片防止氣泡產生影響觀察。如果樹膠較粘稠可以加入適量二甲苯稀釋，使樹膠在封片中能夠快速擴散開。在脫水過后建議采取濕封，即組織上還殘留二甲苯時進行封片，同時注意在通風廚中操作。這樣有助于氣泡排除干凈，不影響后續鏡檢。
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IHC 伊萊瑞特 免疫組織
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