ECL Plus超敏發(fā)光液使用方法

1、常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、HRP 標(biāo)記抗體或核酸探針孵育、洗膜。注意用 HRP 標(biāo)記 IgG 或用一抗-鏈親和素 -生物素-HRP 夾心法。核酸雜交膜用 HRP 標(biāo)記探針雜交，洗膜。

2、在洗滌膜上的 HRP 標(biāo)記二抗的同時，新鮮配制發(fā)光工作液：分別取等體積的溶液 A 和 B 混合，放 置使之恢復(fù)室溫否則會減弱熒光強(qiáng)度。建議立即使用工作液，室溫放置數(shù)小時后仍可使用但靈敏度略有減 低。

3、用鑷子取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液但勿使膜完全干燥。將膜完全浸入并與發(fā)光工作液充分接觸（約 0.125ml 發(fā)光工作液/cm2 膜）。室溫孵育 3 分鐘后立即壓片曝光。孵育時間過長不會增加靈敏度，有時還會 導(dǎo)致曝光條帶異常。發(fā)光過程的本質(zhì)是酶促反應(yīng)，使用過少的發(fā)光工作液不利于反應(yīng)進(jìn)行，也會導(dǎo)致膜上 條帶曝光不均勻和靈敏度明顯降低。為達(dá)節(jié)約目的可將膜剪小但勿降低發(fā)光液用量。

4、用鑷子夾起膜，搭在濾紙上瀝干發(fā)光工作液。但勿洗去發(fā)光液。

5、在 X 光膠片暗盒內(nèi)面鋪一張面積大于膜的保鮮膜。將雜交膜貼在保鮮膜上，將保鮮膜折起來完全包 裹雜交膜，去除氣泡和皺褶，可剪去邊緣部多余的保鮮膜。用濾紙吸去多余的發(fā)光工作液。用膠帶將覆蓋 雜交膜的保鮮膜固定在暗盒內(nèi)，推薦蛋白帶面向上。

6、在黑暗中放入 X 感光膠片，分別曝光不同的時間如數(shù)秒到數(shù)分鐘。顯影沖洗。

ECL Plus超敏發(fā)光液注意事項(xiàng)：

1、步驟 1-5 可在日光燈下操作；但發(fā)光液暴露于強(qiáng)光下時間過久靈敏度可能略有降低，移到暗房操作 可避免。戴手套可以避免在膜上留下手印，保持膜的潔凈。

2、長時間曝光或蛋白質(zhì)過量，將加深背景并使條帶強(qiáng)弱變化失去線性關(guān)系。曝光不足則條帶模糊。 3、發(fā)光工作液孵育約 3 分鐘后膜上的條帶發(fā)光。強(qiáng)條帶發(fā)光在暗房中肉眼可見，低豐度蛋白條帶發(fā)光 較弱，肉眼雖不可見但能使 X 膠片曝光。不能單憑肉眼觀察判斷條帶發(fā)光時間。肉眼不可見的熒光實(shí)際上 可持續(xù)數(shù)小時并使 X 膠片感光，因而弱帶可曝光 1-10 小時。如果曝光后條帶不佳，可用洗膜緩沖液洗膜， 重新孵育二抗，然后重新用 ECL 發(fā)光和曝光。

4、由于超敏發(fā)光液的高靈敏度，強(qiáng)烈推薦大多數(shù)進(jìn)口抗體起始濃度為一抗 1：1000-1：4000，二抗 1： 2000-1：5000�？贵w濃度過高將造成高背景或沒有條帶，導(dǎo)致失��！ Solarbio Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd /82 Http://www.solarbio。。ｃｏｍ

5、某些市售保鮮膜包裹印跡膜時會淬滅熒光，應(yīng)選擇高質(zhì)量保鮮膜，例如“克林萊”牌保鮮膜。

6、使用肉眼可見的預(yù)染色蛋白 Marker 和熒光-放射自顯影曝光標(biāo)簽可幫助確定膠片上條帶的準(zhǔn)確位置 和大小。

7、NaN3 能抑制 HRP 活性，回收二抗時應(yīng)避免使用 NaN3，如必需使用勿超過 0.01%。