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磁珠法RNA pull-down 的經典操作流程

瀏覽次數:10053 發布日期:2018-12-29  來源:www.purimagbead.com

采用鏈霉親和素磁珠(PuriMag G-strep 貨號PMG015)進行RNA pull-down 

RNA pull-down assay using Streptavidin magnetic beads 

 

1. RNA pull-down 第一天——生物素探針標記RNA

1)前期準備:取出Pierce™ RNA 3' End Desthiobiotinylation Kit,將試劑盒中的PEG及DMSO置于常溫,其余組分置于冰上融化,也可將PEG放于37攝氏度融化;打開PCR儀;

2)依照RNA母管含量,用DEPC水溶解RNA,我們通常是10ug/管,用10μl DEPC水溶解。同時溶解試劑盒中Control RNA作為陰性對照;

3)取對照RNA及目標RNA各5 μl,放于200 μl的PCR管中,每管可加1 μl DMSO,混勻后置于PCR儀上,85℃,5min,然后立即置于冰上5min;(DMSO的加入可有助于打開RNA的二級結構,提高RNA ligation的效率)

4)按照下表配制探針標記反應的體系:

成分                                                  體積(μl)    

water                                                         3
10X RNA ligase recation buffer                      3
RNase inhibitor                                           1
Non-labeled RNA                                         5

Biotinylated Cytidine Bisphosphate                1
T4 RNA Ligase                                            2
PEG 30%                                                  15
Total                                                        30

5)混勻上述反應體系,之后放至PCR儀內, 16℃,4h至過夜。反應時間的延長可提高連接效率;

6)連接反應結束后,向每管加400μl nuclease free-water;

7)每管加300 μl酚氯仿提取標記成功的RNA;渦旋后最大轉速離心15min,小心將上層水相移取到新的EP管中;

8)加10 μl 5M NaCl ,2 μl糖原,以及600 μl 預冷的100%乙醇,放于-20℃或-80℃沉淀,可沉淀過夜。


2. RNA pull-down 第二天


1)前期準備

·DTT ,蛋白三聯室溫溶解;
·streptavidin magnetic beads;(S1420, New England Biolabs)
·RNase Inhibitor;
·細胞,10cm大皿若干,長至約80~90%密度;


2)RNA抽提

a)將沉淀過夜的RNA取出,4℃,最大轉速離心30min,離心后可見管底的白色沉淀,及為RNA;

b)小心移取上清,用1ml 70%乙醇洗滌,8000rpm 離心10min,之后吸凈管內液體,空氣中晾干RNA,若乙醇未揮發完全,將影響下游實驗效率;

c)每管加20 μl nuclease free-water溶解RNA,之后將RNA放于PCR儀中,95℃,5min使其變性,之后立即置于冰上,備用。

3)細胞裂解

a)棄去培養基,用預冷的PBS洗3次,吸去上清;

b)每個大皿中加入200μl cell lysis buffer A (加蛋白三聯);

c)用細胞刮刀刮下細胞,收集至EP管,液氮中三凍三融;

d)離心,4℃,3000rpm,離心10min;

e)轉移上清至新的EP管中,置于冰上;可加200U/ml RNase Inhibitor;

f)取10-20 μl左右上清至新管中,作為實驗input組。


4)magnetic beads (PuriMag G-strep 貨號PMG015預處理

a)渦旋混勻beads;

b)每管取400μl beads(如本次實驗中,control RNA 及目的RNA各1管),置于磁力架上,吸去上清;

c)用800μl 1X binding & washing buffer ,洗3次,吸去上清;


5)RNA 與beads結合

a)向上一步的beads中加入400μl 2X binding & washing buffer;

b)向上一步中加入20μl RNA ,再補380μl DEPC水,使其終體積為800μl;

c)室溫慢速旋轉20min,使beads與RNA充分結合;

d)將上一步的管子置于磁力架上,吸去上清;

e)用800μl 1X binding & washing buffer(含RNase Inhibitor, 1U/ μl),洗3次,吸去上清;

f)用cell lysis buffer A 洗一次beads, 吸去上清,注意不要讓beads干掉。


6)RNA與蛋白相互作用

a)向上一步已處理好的beads中每管加入500μl 細胞裂解液(第3步);同時向每管加入RNase Inhibitor, 1U/ μl;

b)4℃慢速旋轉2h,使beads與細胞裂解液充分結合;

c)磁力架上吸去上清,用400 μl新鮮配制的cell lysis buffer A(+RNase Inhibitor+蛋白三聯),洗5次beads;

d)吸去上清,用25μl預冷的0.1% SDS溶液重懸beads,加6.25μl 的5X蛋白上樣緩沖液,100℃金屬浴煮10min.之后立即置于冰上5min,再置于磁力架上吸取上清至新的EP管中,準備蛋白上樣。


7)蛋白的檢測

可采用western blot 或質譜繼續下游蛋白的驗證。

以上就是的RNA pull-down技術的超詳細秘籍啦!

 

更多鏈霉親和素磁珠請參考:

 http://www.purimagbead.com/Product/8271042221.html (200nm鏈霉親和素磁珠)

http://www.purimagbead.com/Product/9728163513.html (1um鏈霉親和素磁珠)

發布者:普瑞邁格生物技術有限公司
聯系電話:15805933710
E-mail:purimag@139.com

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