隨著科學研究的深入，我們對樣品指標的分析要求也越來越高，希望能夠在有限的樣品中獲取盡可能多的數據。多色流式就是一項為此量身定做的實用技術。但如何保證數據質量，在很大程度上取決于優化的配色方案設計。

經常會有初入流式分析的同學來問到，師兄，這個熒光強不強？這個通道能測出來不？是不是抗體不好使？為啥這個補償怎么也調不干凈？為啥（明明）感覺（應該）陽性群不明顯（很明顯）等等問題。其實導致這些問題的原因有很多，可能來源于抗體、熒光素的選擇，樣本處理，上機操作，及后續的分析過程中。本期，讓我們結合流式分析儀的基本原理，來看看多色流式中熒光配色的方案及其原理。

01、首先了解：流式分析的基本步驟

一次完整的流式分析，通�？梢愿爬�為四步走，【樣本制備】→【染色標記】→【上機操作】→【后續分析】。但是在成功地完成一次流式分析之前，我們還需要做大量的準備工作，我們可以將之分為【實驗設計】、【預實驗】。

行兵布陣講究的是謀定而后動，同樣地，做流式分析時實驗設計也相當重要。在這個環節，我們需要對消化方案、抗體標記策略、熒光配色方案等等做初步規劃，并在預實驗中逐步完善，最終在正式實驗中獲得預期的數據結果。

本期，我們主要關注實驗設計中的熒光配色。但在正式討論熒光配色前，我們先來聊一聊流式分析儀的基本原理，相信這會對我們后續更好地運用熒光配色有所幫助。

02、流式分析儀的基本原理

流式分析儀的識別過程可以簡單分為【光信號】→【電信號】→【數字信號】→【輸出】。具體過程如下：

流式細胞術原理圖

1.  光信號的接收識別

分析儀中的光路系統通過激光束照射流動通過的單細胞懸液，產生不同的光信號，其中包括無需激發的物理參數信號（FSC、SSC）和需要一定能量的激光束激發的熒光信號。沒有照射到細胞的激光束，向前直射形成前向散射光信號（FSC），因此在一定范圍內，FSC與細胞的大小正相關；接觸細胞的激光束，產生不同的折射光信號，包括側向散射光信號（SSC）、熒光信號。細胞內的復雜程度越高，折射的SSC信號就越強，因此在一定范圍內，SSC與細胞內的復雜程度成正比。同時，由于SSC信號一般較弱，熒光信號通常能夠從折射光信號中分離出來，再經過不同的濾光片分離，從而被特定的接收器（通道）接收。

2.  光信號的轉換輸出

接下來，光電二極管（用于FSC）、光電倍增管（用于SSC、熒光信號）會將【光信號】轉換成【電信號】，并最終轉換成【數字信號】在圖形界面【輸出】，到此我們就能夠直觀地看到我們所需要的流式圖了。

多色流式分析示例圖（小鼠肺實質細胞群中MO/MΦ/DC相關亞群的參考圈門策略）

因此，如何讓流式分析儀獲取足夠強度并且準確的光信號，是獲得優質流式數據的關鍵。在這里，有兩個關鍵指標：準確性、強度，將成為我們設計熒光配色方案的衡量標準。

03、熒光配色方案之準確性指標

準確性：即如何讓熒光信號和諧共處、各自安好地被識別。一般在閱讀了大量文獻的基礎上（新手上路的默認必須操作，老司機也請注意行車規范），我們會確定在單一樣品中需要標記的不同marker。主要分為以下幾個步驟：

1.  找到在流式分析儀上可識別的熒光素

通常我們會用不同熒光素標記的抗體來結合marker，因此可用的熒光素有數量、種類上的限制。

1）  數量：受到分析儀接收器（通道）的限制，以BD LSRFortessa（以下簡稱Fortessa）為例，選配為5激光18通道，因此單管樣品染色的熒光素【數量】上限為18。

2）  種類：受到激光管波長、濾光片2個因素的限制。以BD FACSCalibur（以下簡稱Calibur）為例，選配為2激光（488nm、635nm）4通道。受到激光管波長的限制，以355nm、405nm激發的熒光素（BUV375、BV421等）并不能在Calibur上應用；受到濾光片的限制， PerCP與PE-Cy7在Calibur上均為488nm激發，均被FL3（670LP）識別接收，不能同時適用。但在Fortessa上能夠二者能分別被488nm、561nm激發，分別被FL2（710/50nm）、FL7（780/60nm）識別接收，能夠同時適用。

2.  在可用的熒光素中，找出能夠和諧共處、各自安好的組合。

流式分析儀識別的熒光信號，一部分來源于激光激發細胞本身蛋白產生的熒光信號，我們稱之為“自發熒光”，另一部分來源于結合到細胞上的抗體耦聯的熒光素被激光激發后產生的信號。

在選用熒光素的時候，首先要盡量避開自發熒光的發射光譜范圍，避免自發熒光對目標熒光信號的干擾。其次，我們要盡可能地基于“熒光素強度”、“相互干擾程度”兩方面和諧共處的原則來選用熒光素。

舉例：以5色標記，Fortessa為例

組合1：PE、PE-eFluor610、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7

組合2：BV421、FITC、PE、PE-Cy7、APC

一般我們可能習慣于根據“熒光素強度”從高到低開始翻牌，但是對于多色流式而言，熒光素之間發射光譜的“相互干擾程度”非常關鍵，輕視它的后果就是會在補償調節的時候讓你調到懷疑人生。

組合1是一個極端配色方案（相信一般人不會想去挑戰這個補償調節），這是一組PE和PE耦聯熒光素的組合，在Fortessa上這個組合均由561nm激發，被范圍接近的濾光片分離，并被接收識別。雖然各自的“熒光素強度”足夠，但是由于在561nm 的激發下，它們的發生光譜有明顯的交叉重疊區域（如圖所示），即它們之間的“相互干擾程度”很高，這會讓補償調節變得相當困難，進而導致信號失真的可能性增大。這個時候，我們會選擇在可接受的范圍內犧牲“熒光素強度”。例如選用熒光強度不那么強的FITC、APC-Cy7等來避開難以調節的補償參數，組合2就在一定程度上，兼顧了“熒光素強度”和“相互干擾程度”。

在561nm激發下，組合1的發射光譜分析

www.bdbiosciences.com/en-us/applications/research-applications/multicolor-flow-cytometry/product-selection-tools/spectrum-viewer

04、熒光配色方案之強度指標

強度：即在滿足準確性的熒光素組合內，通過熒光素的分配，讓我們所有希望了解的marker，都能刷出存在感。在這里給大家2個經驗之談，大神勿噴。

1.  高低搭配，出圖不累。

我們可以將光信號強度理解為【marker豐度×熒光素強度】，因此對于低豐度的marker，我們要拉一把，配一個高強度的熒光素。例如，目標細胞群體為小鼠來源的pDC（漿樣DC），部分marker為Siglec-HloF4/80mid，配色為PE（強）、APC-Cy7（弱），考慮的配色方案為，Siglec-H-PE、F4/80-APC-Cy7。此外，對于低豐度的marker，直接利用陽性群進行補償調節可能會引起信號失真，因此可以考慮采用Compbead捕獲抗體或者采用高豐度marker搭配耦聯同樣熒光素的抗體進行近似調節。

2.  同一層面，補償走開。

在多色流式分析的過程中，我們通常會設置多個邏輯層和門。在同一層次的邏輯設門中，可以考慮避開那些八字不合補償難以調節的熒光配對。例如，層次1（F4/80、Ly-6G）→層次2（CD11b、CD11c），配色為eFluor 450、PE-eFluor 610、FITC、PE。個人考慮的配色方案中，PE與PE-eFluor 610不放在同一邏輯層，采用F4/80-PE-eFluor 610，Ly-6G-eFluor 450，CD11b-FITC，CD11c-PE。如果有童鞋感興趣，可以嘗試把PE、PE-eFluor 610湊對，就會發現存在對角線尖峰，若通過補償調節將尖峰調沒，可能會補償過度，從而導致一些細胞亞群的信號失真，得不償失。

05、總 結

熒光配色的目的，是為了讓流式分析儀能夠“準確”地識別足夠“強度”的熒光信號。

▲ 從準確性出發，我們要根據硬件限制（激光管、通道數、濾光片）選出可用熒光素，在可用熒光素中，根據“熒光素強度”、“相互干擾程度”、“自發熒光”等選出較優的配色組合。

▲ 從強度出發，我們要讓每一個目標marker都能獲得足夠被識別的熒光強度信號，因此要根據“高低搭配”、“邏輯設門”等來作出最終的熒光分配方案。