希爾博士關(guān)于外泌體保存的常見問題的解答
希爾博士在接受外泌體NTA檢測(cè)的技術(shù)咨詢時(shí)，經(jīng)常會(huì)被問到外泌體保存相關(guān)的問題。
譬如：
→我的外泌體已經(jīng)在4度放了一周，還能做檢測(cè)嗎？
→我是1個(gè)月前提取的外泌體，一直放在-80度冰箱，還能做粒徑檢測(cè)嗎？
→我的樣本放在-80度冰箱兩個(gè)月了，還能提取外泌體做檢測(cè)嗎？
→我在沈陽，寄樣本去上海做檢測(cè)，可以用冰袋寄送嗎？
諸如此類………
目前并沒有定論來回答以上問題，
我們應(yīng)該去文獻(xiàn)中尋找可參考的信息，
抑或——最科學(xué)的方式——自行做對(duì)照實(shí)驗(yàn)去探究。
Example 1
數(shù)據(jù)來源：Influence of Storage Condition on Exosome Recovery , DOI: 10.1007/s12257-015-0781-x
實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/strong>探究不同溫度下長(zhǎng)時(shí)間保存對(duì)外泌體樣本的影響
實(shí)驗(yàn)方法：對(duì)HEK 293的細(xì)胞培養(yǎng)上清提取分離外泌體，將外泌體樣本分成4組，分別保存在-70℃、-20℃、4℃和室溫下10天后，進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，選擇的marker為HSP70、CD63、CD9。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：結(jié)果顯示，在-20℃和-70℃下保存的外泌體比較完整無損，而4℃和室溫下CD63已基本沒有表達(dá)，室溫保存條件下HSP70的表達(dá)量也有所降低。
相較于4℃、-70℃和新鮮樣本，室溫存放的外泌體蛋白和RNA濃度的降低程度較明顯。
本例說明，-20℃或更低溫度是比較可取的外泌體長(zhǎng)期存儲(chǔ)條件。
Example 2
數(shù)據(jù)來源：Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses ，DOI: 10.1080/20013078.2017.1359478
實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/strong>探究不同溫度下保存對(duì)外泌體樣本的影響
實(shí)驗(yàn)方法：提取分離小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的外泌體，將外泌體樣本分為三組——新鮮提取組和分別保存在-80℃、4℃ 4天的兩組，通過DLS、TEM和zeta電位觀察外泌體的變化。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：結(jié)果顯示，相較于新鮮提取的外泌體樣本，低溫儲(chǔ)存4天的樣本粒徑有一定程度的增大，電位數(shù)值降低，顆粒有團(tuán)聚傾向；從TEM圖片看，-80℃保存的外泌體有多層結(jié)構(gòu)產(chǎn)生。
另外，該實(shí)驗(yàn)也通過無標(biāo)記的LC-MS/MS評(píng)估了外泌體蛋白質(zhì)含量，結(jié)果表明低溫儲(chǔ)存一定時(shí)間都會(huì)引發(fā)蛋白質(zhì)泄露。所以，不論是從外泌體結(jié)構(gòu)還是蛋白質(zhì)含量角度出發(fā)，最好是在分離后立即進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。
Example 3
數(shù)據(jù)來源：Handling and storage of human body fluids for analysis of extracellular vesicles, DOI: 10.3402/jev.v4.29260
實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/em>探究單次凍融和不同時(shí)間、溫度儲(chǔ)存對(duì)血漿EVs的影響
實(shí)驗(yàn)方法：血漿在新鮮狀態(tài)和分別在-20℃、-80℃、-196℃儲(chǔ)存6個(gè)月和1年后被檢測(cè)，通過RPS、NTA和FCM觀察粒徑和濃度的變化。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：圖a-d的RPS和NTA結(jié)果說明不同溫度下儲(chǔ)存6個(gè)月和1年對(duì)樣本濃度和粒徑影響不明顯，CD235a和CD61的表達(dá)量也沒有太大差異，只有l(wèi)actadherin的表達(dá)相對(duì)于新鮮樣本升高了約7倍（圖e）。綜上說明，該研究中用到的血漿樣本在不同溫度下（低溫）儲(chǔ)存，即便長(zhǎng)達(dá)1年，也能保持一定的穩(wěn)定性。
同篇文章對(duì)唾液和尿液樣本也做了類似研究，得到相近結(jié)果。
白色：新鮮血漿；灰色：血漿凍存6個(gè)月；黑色：血漿凍存1年
也有研究團(tuán)隊(duì)對(duì)不同儲(chǔ)存條件對(duì)外泌體中miRNA穩(wěn)定性做評(píng)估：miRNA in Plasma Exosome is Stable under Different Storage Conditions (doi:10.3390/molecules19021568)。
從這幾個(gè)例子來看，不同時(shí)間、溫度的保存對(duì)不同的外泌體樣本影響不一；如果研究方向?yàn)橥饷隗w形態(tài)特征、蛋白或其他功能性分析，在分離后新鮮使用為最佳。目前主流的建議是提取出外泌體后最好是新鮮使用，或低溫短期保存。
而到底低溫保存一定時(shí)間后是否對(duì)外泌體有什么影響，希爾博士認(rèn)為還是因樣本而異，實(shí)在糾結(jié)的話，還是做對(duì)比實(shí)驗(yàn)，用實(shí)際數(shù)據(jù)說話！
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