基因編輯（gene editing），又稱基因組編輯（genome editing）或基因組工程（genome engineering），是一種新興的比較精確的能對生物體基因組特定目標基因進行修飾的一種基因工程技術。基因編輯技術指能夠讓人類對目標基因進行定點“編輯”，實現對特定DNA片段的修飾。
 

目前廣泛使用的基因編輯技術是CRISPR-Cas9，它是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR-Cas9基因編輯技術，則是對靶向基因進行特定DNA修飾的技術，這項技術也是用于基因編輯中前沿的方法。該技術在一系列基因治療的應用領域都展現出極大的應用前景，但過大的蛋白分子成為CRISPR未來應用方式中最重要的瓶頸之一。

最近，來自美國加利福尼亞大學伯克利分校創新基因組學研究所的研究人員發現了一種新型基因編輯工具——CasΦ，它是一種功能最小的CRISPR-Cas系統，由1〜70 KD的CasΦ蛋白和一個CRISPR陣列組成，且僅在巨型噬菌體的基因組中編碼，其體積是CRISPR-Cas 9的一半，這項研究成果于7月16日發表在《Science》雜志上。
 

DOI: 10.1126/science.abb1400
本研究中，CasΦ（Cas12j）是巨型噬菌體分枝中編碼的Cas蛋白家族，巨型噬菌體用它來誘使細菌抵抗自身而不是自身的病毒。它使用單個活性位點進行CRISPR RNA（crRNA）加工和crRNA指導的DNA切割，以靶向外來核酸。從進化關系而言，CasΦ或許更為“古老”，其與V型CRISPR-Cas蛋白的同源性不足7%，但與V型CRISPR-Cas蛋白的源頭TnpB核酸酶超家族的部分蛋白有更高同源性。研究發現，CasΦ借助于單一向導RNA的引導，并依賴于PAM位點的指引以實現目標DNA的識別（其中CasΦ-2所識別的PAM序列為5’-TBN-3’（B=G,T,C））。
 

研究人員在論文中還研究了來自宏基因組的三個不同的CasΦ直系同源物：CasΦ-1，CasΦ-2和CasΦ-3。為了檢驗CasΦ在細菌細胞中識別和靶向DNA 的能力，他們測試了CasΦ 是否可以保護大腸桿菌免于質粒轉化。他們首先試圖確認核酸酶是否像其他Cas核酸酶一樣使用前間區序列鄰近基序（PAM）來靶向DNA序列，因此他們轉化了一個包含crRNA互補靶位點附近隨機區域的質粒文庫，從而減少含有功能性PAM的質粒。這揭示了CasΦ具有靶向crRNA引導的雙鏈DNA（dsDNA）的能力。
 

隨后，研究人員使用大腸桿菌表達系統和質粒干擾試驗確定了CRISPR- CasΦ系統運行所需的組件。他們觀察到casΦ基因的轉錄和減少的CRISPR陣列，但沒有證據表明其他非編碼RNA，例如基因座內的反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）。此外，CasΦ活性可以通過改變引導RNA來重新編程為靶向其他質粒序列，這表明其天然環境中的核酸酶是一種功能性噬菌體蛋白，以及能夠切割crRNA互補DNA的CRISPR-Cas效應子。數據還表明，該單一RNA系統比其他活性CRISPR-CAS系統更加緊湊。
 

接下來，研究小組需要了解CasΦ在體外對DNA的識別和裂解要求。結果表明，CasΦ的裂解活性僅在識別順式DNA時才能觀察到，而且只需要最低的PAM條件，這可能有利于更廣泛的核酸檢測。
最后，為了研究CasΦ是否能用于人類基因組編輯，研究人員在HEK293細胞中使用了與crRNA共表達的CasΦ進行了基因破壞測定。他們發現，CasΦ-2和CasΦ-3誘導了基因組整合增強型綠色熒光蛋白（EGFP）基因的定向破壞。其中，具有單個指導RNA的CasΦ-2能夠編輯多達33％的細胞，這與先前報道的CRISPR-Cas9，CRISPR-Cas12a和CRISPR-CasX的水平相當。
 

巨噬細胞編碼的CasΦ在其宿主的超感染情況下的功能示意圖
 

總結：CasΦ的小尺寸及其最小的PAM需求將特別有利于基于載體的細胞內轉運，以及更廣泛的可靶向基因組序列。此外，其緊湊的特質使其特別適合工程和實驗室進化，可創造用于基因組操作的新功能。當考慮核酸酶在臨床上未來的潛力時，Al-Shayed補充說，由于它來自環境噬菌體，而不是致病菌或人類腸道細菌，這可能使其成為更好的治療工具。 但其進一步功能和可能的應用方面仍有許多工作要做。例如，其脫靶效應的潛力尚未得到測試。重要的是，這項研究展示了噬菌體來源的Cas系統的潛力，并且表明CRISPR更廣泛的生物學機制仍然未知。
 

參考：Pausch Patrick,Al-Shayeb Basem,Bisom-Rapp Ezra et al. CRISPR-CasΦ from huge phages is a hypercompact genome editor.[J] .Science, 2020, 369: 333-337.