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文章詳情

文章題目：Midkine expression by stem-like tumor cells drives persistence to mTOR inhibition and an immune-suppressive microenvironment

中文題目：干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞的Midkine表達(dá)驅(qū)動(dòng)mTOR抑制和免疫抑制微環(huán)境的持續(xù)

見(jiàn)刊時(shí)間：2022.08

期刊名稱：nature communications

影響因子：17.694

實(shí)驗(yàn)平臺(tái)：10x Genomics scRNA-seq、10x Visium spatial transcriptomics profiling

DOI：10.1038/s41467-022-32673-7

 

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圖解摘要

我們之前詳細(xì)介紹了研究者對(duì)AML 和 LAM的單細(xì)胞分析、AML細(xì)胞中的通路和遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的圖譜以及AML腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)為兩種主要狀態(tài):干細(xì)胞樣和炎性，現(xiàn)對(duì)接下來(lái)中間部分的內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)介紹。

 

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研究?jī)?nèi)容

AML細(xì)胞的干細(xì)胞樣細(xì)胞群可能與雷帕霉素耐藥有關(guān)

研究者觀察到腫瘤細(xì)胞亞群的干性和休眠性增強(qiáng)，這是耐藥性腫瘤細(xì)胞的典型特征，這促使研究者直接研究雷帕霉素在AML細(xì)胞中的耐藥性。他們從本研究分析的AML腫瘤之一做了原代培養(yǎng)，并用DMSO（對(duì)照）或雷帕霉素（實(shí)驗(yàn)）處理這些細(xì)胞，然后進(jìn)行scRNA-Seq分析（圖3a），聚類確定了7個(gè)細(xì)胞群（圖3b），AML細(xì)胞占33%（圖3c）。集群4包含來(lái)自對(duì)照組和雷帕霉素治療組的AML細(xì)胞，表明它包含對(duì)雷帕霉素有抵抗力的細(xì)胞，或者至少是轉(zhuǎn)錄沒(méi)有被雷帕霉素治療改變的細(xì)胞。在這個(gè)集群中，許多AML腫瘤標(biāo)志基因的表達(dá)不受雷帕霉素的影響，而在其他集群中雷帕霉素抑制了這些腫瘤基因的表達(dá)，例如CTSK（圖3d）。此外，第4群中的細(xì)胞顯示出高干性評(píng)分（圖3e）和高休眠評(píng)分（圖3f和補(bǔ)充圖6c）。NR2F1調(diào)節(jié)子的活性在這個(gè)簇中也很高（圖3g）。

據(jù)報(bào)道，MDK在其他腫瘤中介導(dǎo)耐藥性，為了確定MDK是否參與雷帕霉素耐受，以及MDK是否受TSC途徑的調(diào)節(jié)，研究者使用了兩種TSC的細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)與TSC2-reexpressing 621-103細(xì)胞相比，在TSC2缺陷的AML患者衍生的621-101細(xì)胞中，以及與TSC2-add back TTJ+ TSC2細(xì)胞相比，MDK的表達(dá)上調(diào)了（圖3h）。與對(duì)照組相比，患者來(lái)源和小鼠來(lái)源的TSC2缺陷細(xì)胞系中的MDK水平都明顯升高（圖3i）。接下來(lái)，研究者用DMSO、雷帕霉素（20 nM）、iMDK（MDK抑制劑，1 µM）或雷帕霉素（20 nM）和iMDK（1 µM）的組合處理TSC2缺陷細(xì)胞（621-101，TTJ）和正常人類成纖維細(xì)胞（NHLF）。在所有3個(gè)細(xì)胞系中，單獨(dú)使用iMDK處理的效果最小。當(dāng)與雷帕霉素結(jié)合時(shí)，iMDK對(duì)兩個(gè)TSC2缺失的細(xì)胞系有協(xié)同作用（圖3j）。他們將協(xié)同作用定義為兩種藥物的綜合效果大于每種藥物的單獨(dú)活性之和。為了確定iMDK是否在體內(nèi)使腫瘤對(duì)雷帕霉素治療敏感，他們使用TSC2缺陷的TTJ細(xì)胞在免疫缺陷的無(wú)胸肌裸鼠體內(nèi)產(chǎn)生皮下腫瘤。與單獨(dú)使用雷帕霉素相比，iMDK和雷帕霉素的聯(lián)合治療導(dǎo)致了更快的腫瘤反應(yīng)的發(fā)生，以及更低的腫瘤負(fù)擔(dān)，而單獨(dú)使用iMDK沒(méi)有明顯的效果（圖3k，補(bǔ)充圖6d）。

圖3. AML細(xì)胞的干細(xì)胞群可能有助于雷帕霉素的抗性a

 

異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞狀態(tài)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的重塑

研究者探究了SLS和IS對(duì)腫瘤微環(huán)境的潛在不同影響。在6個(gè)AML樣本中，2個(gè)AML主要由IS組成（>70%），4個(gè)主要是SLS（>80%）（圖4a）。以SLS為主的腫瘤有更多的內(nèi)皮細(xì)胞（圖4b）。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，他們對(duì)每個(gè)AML進(jìn)行了內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31的免疫組化（IHC）染色，發(fā)現(xiàn)與scRNA-Seq預(yù)測(cè)的百分比有很強(qiáng)的相關(guān)性（圖4c），在SLS主導(dǎo)的腫瘤中內(nèi)皮細(xì)胞的百分比更高（圖4d，補(bǔ)充圖7a）。差異表達(dá)分析顯示，MDK的表達(dá)要比VEGFD高得多，MDK在群集1（SLS）中表達(dá)較高，而VEGFD在群集3（IS）中表達(dá)較高 (圖4e)。這些數(shù)據(jù)表明，SLS腫瘤中促血管生成的MDK的高表達(dá)可能是該亞型AML中富含內(nèi)皮細(xì)胞的原因。

圖4. 以SLS為主的腫瘤的內(nèi)皮細(xì)胞重塑

 

scRNA-Seq和scTCR-Seq的綜合分析揭示了SLS優(yōu)勢(shì)腫瘤的T細(xì)胞功能障礙和抑制的克隆擴(kuò)展

在人類TSC腫瘤中已經(jīng)觀察到T細(xì)胞的浸潤(rùn)和衰竭，并且在小鼠模型中觀察到免疫療法的明顯益處。為了確定T細(xì)胞是否受到AML中腫瘤細(xì)胞狀態(tài)的影響，研究者重點(diǎn)研究了4個(gè)與正常腎臟配對(duì)的AML，其中2個(gè)以SLS為主，2個(gè)以IS為主。對(duì)腫瘤來(lái)源的CD8+T細(xì)胞進(jìn)行重新聚類，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)主要的細(xì)胞群：記憶/免疫T細(xì)胞（CD8 Tm/naive）、效應(yīng)T細(xì)胞（CD8 Teff）和增殖T細(xì)胞（CD8 T-prolif），以及每個(gè)主要細(xì)胞群中的亞群，它們具有不同的免疫檢查點(diǎn)基因或細(xì)胞毒性效應(yīng)基因的表達(dá)（圖5a，b）。來(lái)自SLS優(yōu)勢(shì)腫瘤的CD8+T細(xì)胞與來(lái)自IS優(yōu)勢(shì)腫瘤的CD8+T細(xì)胞相比，顯示出更低的細(xì)胞毒性分?jǐn)?shù)，而且每個(gè)亞群內(nèi)的細(xì)胞毒性細(xì)胞（定義為表達(dá)至少一種細(xì)胞毒性效應(yīng)基因）的百分比也較低（圖5c）。此外，SLS主導(dǎo)的腫瘤衍生細(xì)胞表現(xiàn)出更高的衰竭分?jǐn)?shù)（圖5c）。盡管每個(gè)亞群中衰竭細(xì)胞的頻率大致相同（圖5c），但SLS主導(dǎo)的腫瘤中衰竭的CD8+Teff細(xì)胞的比例高于IS主導(dǎo)的腫瘤，而IS主導(dǎo)的腫瘤顯示出更高的細(xì)胞毒性CD8+Teff和CD8+Tm/Naive群體的頻率（圖5d）。對(duì)腫瘤來(lái)源的CD4+T細(xì)胞的類似分析顯示了6種CD4+T細(xì)胞的亞型（圖5e，f）。雖然來(lái)自IS顯性腫瘤的記憶型CD4+T細(xì)胞和CD40LG高的群體顯示出較高的細(xì)胞毒性分?jǐn)?shù)（圖5g），但在SLS顯性腫瘤和IS顯性腫瘤之間沒(méi)有觀察到任何亞型的細(xì)胞頻率的明顯差異（圖5h）。

腫瘤激活的淋巴細(xì)胞會(huì)發(fā)生克隆性擴(kuò)增，來(lái)自同一克隆的擴(kuò)增T細(xì)胞具有相同的TCR序列（克隆型）。研究者發(fā)現(xiàn)在以IS為主的腫瘤中，有229個(gè)克隆型在CD8+T細(xì)胞亞型中共享，319個(gè)克隆型在CD4+T細(xì)胞亞型中共享，但在以SLS為主的腫瘤中只有5個(gè)克隆型在CD8+T亞型中共享（圖5i）。SLS腫瘤在CD8+T群體中顯示出相當(dāng)有限的亞型之間的克隆型共享，而在CD4+T群體中沒(méi)有克隆型共享，而IS腫瘤在CD8+T和CD4+T群體中都顯示出亞型之間廣泛的克隆型共享（圖5j）。CD8+ Teff亞型中75%的擴(kuò)增TCRs與IS腫瘤中的CD8+ Tm/Naive亞型共享，顯示了這兩種CD8+ T細(xì)胞狀態(tài)之間的動(dòng)態(tài)聯(lián)系。在IS腫瘤中，大多數(shù)增殖的CD8+T細(xì)胞與CD8+Teff群體共享克隆型，這可能意味著腫瘤抗原反應(yīng)性T細(xì)胞增殖（圖5j）。增殖的T細(xì)胞與兩個(gè)細(xì)胞毒性Taff群體（CD8 Teff-TNF和CD8 Teff-IFNG）共享大量的克隆型。此外，在CD8 Teff和兩個(gè)細(xì)胞毒性Teff群體（CD8 Teff-TNF和CD8 Teff-IFNG）之間觀察到廣泛的克隆共享，這表明向功能性T細(xì)胞分化的軌跡是活躍和動(dòng)態(tài)的。這些觀察結(jié)果表明，在IS腫瘤中觀察到的高頻率的細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞，至少部分是由于可能的腫瘤識(shí)別效應(yīng)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)分化。研究者使用RNA速率分析支持了從CD8效應(yīng)T細(xì)胞到增殖T細(xì)胞以及從多個(gè)CD4+T亞群到Tregs的分化軌跡（圖5k）。相反，以SLS為主的腫瘤顯示出亞型之間有限的分化潛力。

圖5. 在SLS主導(dǎo)的腫瘤中，T細(xì)胞功能紊亂和T細(xì)胞克隆擴(kuò)展受到抑制