一、前言：

多重熒光免疫組化(mIHC)主要的技術原理來自TSA技術，TSA即酪酰胺信號放大，是一類利用辣根過氧化酶(HRP)對靶蛋白或核酸進行高密度原位標記的酶學檢測方法。用這種方法做多重熒光染色是利用二抗上帶有的HRP（而不是直接偶聯熒光素），來催化后續添加入體系的非活性熒光素，該熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價偶聯，使得蛋白樣品與熒光素穩定結合。然后進行微波處理，前一輪非共價結合的抗體被洗掉，共價結合的熒光素還留存在樣品上。再換個一抗來第二輪孵育，周而復始。等到所有抗體孵育結束，熒光素都結合好后，最后去檢測結果。

因為涉及到多次微波，似乎也只有石蠟切片能經得起這番造作，而手中只有冰凍樣本的老師，以往只能望洋興嘆，因為冰凍切片經不起甚至一輪的熱處理。但隨著技術的發展，這個難題也在逐漸被攻克，為了使得更多老師能夠用上mIHC這項技術，Absin推出了抗體洗脫液(abs994)，現在一起來看看冰凍切片的多色實驗該如何開展吧~

二、建議操作步驟：

1、樣本準備

1）固定包埋：獲取新鮮組織，用4%多聚甲醛低溫固定，PBS緩沖液洗三次，每次15min；30%蔗糖沉降脫水，OCT包埋；
2）切片：使用冷凍切片機，將組織冰切成3-5μm的切片（對于儲存在-80℃下的組織，制備切片前，需轉移到-20℃冰箱中平衡約15min），粘貼于防脫載玻片上，室溫晾片30-60min。切片放入PBS中浸洗3次，每次5min，去除OCT；
3）淬滅內源性過氧化物酶：滴加3% H2O2，室溫下孵育10-30min，PBS浸洗5min×3次。

2、多色實驗
1）封閉：滴加封閉液，室溫孵育30min，除去封閉液；
2）一抗孵育：棄封閉液，滴加稀釋好的的一抗工作液，于避光濕盒內4°C孵育過夜或37℃ 1-2h（濕盒中可加少量水，防止抗體孵育過程干片），PBS浸洗5min×3次；
3）二抗孵育：滴加與一抗相應種屬的HRP二抗覆蓋組織，避光室溫孵育20-50min，PBS浸洗5min×3次；
4）染料孵育：滴加現配的1*TSA染料工作液（使用信號放大液按1:100稀釋），反應2-15min，PBS浸洗5min×3次；
5）抗體洗脫：滴加適量37℃預熱至完全溶解的抗體洗脫液(abs994)覆蓋樣本，10s后甩去，再次滴加抗體洗脫液沒過整個樣本并稍微鼓起，37℃濕盒孵育5-20min（根據切片厚度，一抗種類調整洗脫溫度和時間，洗脫難度：結構性膜蛋白和細胞骨架蛋白＞胞漿蛋白＞胞核蛋白），PBS浸洗5min×3次；
6）重復進行[1封閉→5抗體]洗脫過程，直到完成所有指標染色；
7）滴加1*DAPI工作液到樣品上，浸沒樣本區域，室溫孵育10min，PBS浸洗5min×3次；
8）滴加抗熒光淬滅封片劑，用蓋玻片封片，避免氣泡；
9）掃描成像，數據分析。

三、注意事項：

1、若某些抗體難以洗脫，建議降低一抗稀釋比例，或將該靶點排到最后一輪進行染色；
2、抗體洗脫液在使用時要根據實際情況調整孵育時間和洗脫溫度，若時間太長有可能損傷抗原靶點以及細胞核形態；
3、請在包埋之前先固定樣本，切片后固定可能不耐受多次標記與洗脫；
4、冰凍切片請控制切片厚度不超過5um，太厚的樣本可能影響染色效果。

雖然抗體洗脫液解決了冰凍切片無法熱修復的問題，但多輪洗脫依舊可能存在脫片的情況，可用白片進行多次抗體洗脫判斷片子的耐受情況，來決定最終染色的靶點數量。