ELISA試驗夾心、間接及競爭測定法的操作過程
ELISA（酶聯免疫吸附試驗）是一種免疫測定方法，通常用于量化樣品中特定目標的水平。常規用于ELISAs的樣本包括血清、血漿、細胞培養上清液、細胞裂解液、唾液、組織裂解液和尿液。酶聯免疫吸附試驗通常在96孔微孔板中進行，微孔板上涂有對相關分析物的特異性捕獲抗體。在與實驗樣品、標準品或對照品孵化時，目標分析物被該抗體捕獲，一個共軛的檢測抗體與目標分析物上的不同表位結合。隨后加入底物溶液，產生一個與分析物結合量成比例的信號。ELISA的三個主要方法是夾心法、間接法、和競爭法，每種類型的ELISA都有自己的優勢和劣勢。
操作過程如下：
1 、夾心法：
原理：針對抗原分子上2個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物。
夾心法常用于檢測大分子抗原，一般的操作步驟為:
a. 將具有專一性的抗體固著（coating）于塑膠孔盤上，完成后洗去多余抗體
b. 加入待測檢體，檢體中若含有待測的抗原，則其會與塑膠孔盤上的抗體進行專一性鍵結
c. 洗去多余待測檢體，加入另一種對抗原專一的一次抗體，與待測抗原進行鍵結
d. 洗去多余未鍵結一次抗體，加入帶有酶的二次抗體，與一次抗體鍵結
e. 洗去多余未鍵結二次抗體，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或儀器讀取呈色結果
2、間接法
原理：利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體。
間接法常用于檢測抗體，一般的操作步驟為：
a. 將已知的抗原固著于塑膠孔盤上，完成后洗去多余的抗原。
b. 加入待測檢體，檢體中若含有待測的一次抗體，則其會與塑膠孔盤上的抗原進行專一性鍵結。
c. 洗去多余待測檢體，加入帶有酶的二次抗體，與待測的一次抗體鍵結。
d. 洗去多余未鍵結二次抗體，加入酶底物使酶呈色，藉儀器（ELISA reader）測定塑膠盤中的吸光值（OD值），以評估有色終產物的含量即可測量待測抗體的含量。
3、競爭法
原理：將特異性抗體包被于固相載體表面，經洗滌后分成兩組：一組加酶標記抗原和被測抗原的混合液，另一組只加酶標記抗原，經孵育洗滌后加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為所要測定的未知抗原的量。
競爭法是一種較少用到的ELISA檢測機制，一般用于檢測小分子抗原，其操作步驟為：
a. 將具有專一性的抗體固著于塑膠孔盤上，完成后洗去多余抗體
b. 加入待測檢體，使檢體中的待測抗原與塑膠孔盤上的抗體進行專一性鍵結
c. 加入帶有酶的抗原，此抗原也可與塑膠孔盤上的抗體進行專一性鍵結，由于塑膠孔盤上固著的抗體數量有限，因此當檢體中抗原的量越多，則帶有酶的抗原可鍵結的固著抗體就越少，亦即，兩種抗原皆競相與塑膠孔盤上抗體鍵結，即所謂競爭法之由來。
d. 洗去檢體與帶有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，當檢體中抗原量越多，代表塑膠孔盤內留下之帶有酶的抗原越少，顯色也就越淺。
e. 當需要偵測無法獲得兩種以上單一性抗體的抗原，或是不易得到足夠的純化抗體以固著于孔盤上時，一般會考慮使用競爭法ELISA。
操作過程如下：
1 、夾心法：
原理：針對抗原分子上2個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物。
夾心法常用于檢測大分子抗原，一般的操作步驟為:
a. 將具有專一性的抗體固著（coating）于塑膠孔盤上，完成后洗去多余抗體
b. 加入待測檢體，檢體中若含有待測的抗原，則其會與塑膠孔盤上的抗體進行專一性鍵結
c. 洗去多余待測檢體，加入另一種對抗原專一的一次抗體，與待測抗原進行鍵結
d. 洗去多余未鍵結一次抗體，加入帶有酶的二次抗體，與一次抗體鍵結
e. 洗去多余未鍵結二次抗體，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或儀器讀取呈色結果
2、間接法
原理：利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體。
間接法常用于檢測抗體，一般的操作步驟為：
a. 將已知的抗原固著于塑膠孔盤上，完成后洗去多余的抗原。
b. 加入待測檢體，檢體中若含有待測的一次抗體，則其會與塑膠孔盤上的抗原進行專一性鍵結。
c. 洗去多余待測檢體，加入帶有酶的二次抗體，與待測的一次抗體鍵結。
d. 洗去多余未鍵結二次抗體，加入酶底物使酶呈色，藉儀器（ELISA reader）測定塑膠盤中的吸光值（OD值），以評估有色終產物的含量即可測量待測抗體的含量。
3、競爭法
原理：將特異性抗體包被于固相載體表面，經洗滌后分成兩組：一組加酶標記抗原和被測抗原的混合液，另一組只加酶標記抗原，經孵育洗滌后加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為所要測定的未知抗原的量。
競爭法是一種較少用到的ELISA檢測機制，一般用于檢測小分子抗原，其操作步驟為：
a. 將具有專一性的抗體固著于塑膠孔盤上，完成后洗去多余抗體
b. 加入待測檢體，使檢體中的待測抗原與塑膠孔盤上的抗體進行專一性鍵結
c. 加入帶有酶的抗原，此抗原也可與塑膠孔盤上的抗體進行專一性鍵結，由于塑膠孔盤上固著的抗體數量有限，因此當檢體中抗原的量越多，則帶有酶的抗原可鍵結的固著抗體就越少，亦即，兩種抗原皆競相與塑膠孔盤上抗體鍵結，即所謂競爭法之由來。
d. 洗去檢體與帶有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，當檢體中抗原量越多，代表塑膠孔盤內留下之帶有酶的抗原越少，顯色也就越淺。
e. 當需要偵測無法獲得兩種以上單一性抗體的抗原，或是不易得到足夠的純化抗體以固著于孔盤上時，一般會考慮使用競爭法ELISA。
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