免疫組織化學是應用抗原和抗體結合的原理，檢測細胞內多肽、蛋白質等大分子物質的分布。這種方法的特異性強、敏感度高、發展迅速、應用廣泛，成為生物學和醫學眾多學科的重要研究手段。做免疫組化可能遇到許多問題，大體歸納起來，主要有非特異性著色﹑著色部位不對﹑假陽性﹑無陽性﹑陽性弱五大類以及其他一些小問題。現在就以上幾點分別說明。

1、非特異性著色

非特異性著色就是在理論著色區域外的著色，這種著色與背景是有區別性的。造成非特異性著色的原因主要有：

1) 標本原因，肝腎內源性生物素含量高，與 SABC 結合導致非特異性著色，皮膚，肺組織膠原含量高，由于膠原帶負電荷，易吸附試劑導致非特異性著色。

2) 切片干涸導致的邊緣效應。

3) 抗體濃度過高。

4) 組織在處理中存在出血區或壞死區。

5) 洗滌不充分。

6) 顯色劑氧化，顯色時間長。

解決方法 ：

1) 一抗應做濃度梯度，選擇陽性強背景好，信躁比高的濃度，做為抗體實驗濃度。二抗濃度和時間一般不變。

2) 穩定實驗條件，嚴格按操作說明進行。

3) 在實驗中應保持切片始終處于水平狀態避免抗體流失，從而使切片使切片干涸。

4) 在實驗中應將試劑覆蓋面積大于切片面積

5) 洗滌要充分，在背景十分深時，可用 37 ℃ 預溫的 PBS 浸泡

6) 顯色劑的配制要防止氧化，尤其是顯色劑的配制是使用的用的容器，最好是滅菌過的。顯色時間應在顯微鏡下嚴格控制。

2、著色部位不對

著色部位不對有三種情況。

情況一 : 本是胞漿抗原，但實驗顯示結果卻在胞核有著色。

原因及解決辦法：

1) 修復時間過長，修復條件十分嚴苛，這時應降低反應強度

2) 組織在二甲苯中靜置時間過長，這時應更換標本。

3) 抗體中含有抗核蛋白抗體，這種情況已不多見。

4) 標本原因，標本處理不慎會導致總在同一個地方出現著色。

情況二 : 本是胞核抗原但顯示結果卻在胞漿。

原因及解決辦法：

1) 核抗原不易暴露，需用熱修復或延長修復時間來充分暴露。

2) 蛋白質是在胞漿翻譯的，再轉運至其他部位，所以出現漿著色也屬正常。

情況三 : 本是胞膜抗原但顯示結果卻是在胞漿和胞膜都有著色。

原因：蛋白質是在胞漿翻譯的，再轉運至其他部位，處于轉運過程中的膜蛋白有可能顯示在胞漿。

3、假陽性

如不加一抗也有陽性信號主要原因是二抗引起的交叉，球蛋白是一個超家族，哺乳動物種屬來緣近的容易發生交叉反應。如：羊抗兔抗體可與兔標本中球蛋白反應，二抗羊抗小鼠也可與大鼠，小鼠中的球蛋白起反應，尤其在修復的情況下。

4、無陽性

原因：

1) 抗原穩定性問題，由于許多蛋白質半衰期短易被破壞。

2) 標本制作過程中烤片時間過高時間過長，標本制作不規范。

3) 實驗中漏加試劑，實驗操作不規范。

解決方法：

1) 在標本固定中應該嚴格操作，做到及時固定。

2) 在浸蠟時溫度不要太高，時間不要過長。一般 2小時×2次。烤片溫度一般在60℃左右2小時。

3) 實驗中要嚴格按照實驗步驟操作。在所做指標既有單抗又有多抗時，要將一抗和二抗嚴格對應。

5、陽性弱

原因及解決方法：

1) 一抗濃度過低，解決方法：提高一抗濃度

2) 孵育時間過短，解決方法：按說明書嚴格操作

3) 抗體流失，解決方法：補加抗體

4) 顯色時間過短，解決方法：在顯微鏡下控制反應時間

5) 抗原修復方法不當，抗原修復有許多種方法，如：修復、消化，不消不修，尋找適合的方法是解決陽性弱的有效方法之一。

6、其他問題及注意事項

在實驗中尤其在修復后切片容易脫片。切片脫片的原因是什么？

答：切片原因有以下幾點。 1). 切片沒有經過防脫片處理。

 2). 在切片后沒有及時烤片。

 3). 修復時間過長。

來源：BOSTER

 

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