這真是一個可怕的事實：同為黃種人，生長在中國的肝病發(fā)病率卻是生活在歐美的3倍！中國無疑成為了“肝病大國”，約12個人就有1人患肝病。面對如此嚴(yán)峻的現(xiàn)狀，對肝相關(guān)疾病機(jī)制研究和藥物開發(fā)就變得極為迫切。
肝臟是人體重要的器官，執(zhí)行合成代謝、解毒和免疫防御等許多功能。外界環(huán)境各類因素常導(dǎo)致肝損傷，長期的肝損傷將誘發(fā)如肝炎、肝硬化和肝癌等疾病，最終會導(dǎo)致肝衰竭（如下圖）。

圖1. 肝損傷不同階段

目前，針對各種肝損傷疾病仍然是無藥可治，肝細(xì)胞移植成為治療終末期肝損傷最有效的方法之一，然而卻面臨著供體肝細(xì)胞來源匱乏、細(xì)胞活力不足及免疫排斥等諸多挑戰(zhàn)。因此，科研工作者在研究肝疾病的過程中，選擇準(zhǔn)確的肝疾病動物模型對推動肝病治療至關(guān)重要。
肝損傷相關(guān)動物模型

外源性誘導(dǎo)：主要是指化學(xué)性肝損傷動物模型是通過化學(xué)性肝毒物質(zhì)，如四氯化碳（CCL₄）、丙烯醇、D一氨基半乳糖、呋喃等化學(xué)物質(zhì)致肝損傷。

舉例：CCL₄可以誘發(fā)急性和慢性肝損傷，CCL4在肝臟細(xì)胞微粒體內(nèi)的細(xì)胞色素P450的作用下，產(chǎn)生自由基及一系列氧活性物，使細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等發(fā)生氯烷基化和脂質(zhì)過氧化，損傷膜的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡。但是損傷程度無法達(dá)到肝臟再殖程度，很難模擬外界細(xì)胞植入過程。

缺陷：外源性的再生刺激對宿主細(xì)胞同樣有增殖作用，不能產(chǎn)生持續(xù)的肝損傷。

內(nèi)源性肝損傷模型：主要是指基因突變的肝損傷模型，即動物體內(nèi)可以持續(xù)發(fā)生肝損傷過程。這里應(yīng)用的最廣泛的主要是指：Fah^－/－基因敲除動物模型。

Fah^－/－基因敲除動物模型

Fah基因編碼延胡索酰乙酰乙酸水解酶 (Fumarylacetoacetatehydrolase，F(xiàn)ah)，正常情況下，酪氨酸最終代謝為延胡索酰和乙酰乙酸。酪氨酸代謝機(jī)制（下圖 2）

圖2.酪氨酸代謝途徑及致病機(jī)制

模型特征：Fah^－/－基因敲除后，具備I型酪氨酸血癥(Hereditary tyrosinemia type1，HT1)典型特征。Ⅰ型酪氨酸血癥是一種因代謝酪氨酸最后一步反應(yīng)所需的延胡索酰乙酰乙酸水解酶的缺失或功能缺乏而導(dǎo)致的常染色體隱性遺傳疾病。該酶是由Fah基因編碼，正常情況下，酪氨酸最終代謝為延胡索酰和乙酰乙酸；

當(dāng)Fah基因發(fā)生缺失或突變，產(chǎn)生有毒的延胡索酰乙酰乙酸鹽和馬來酰乙酰乙酸，并產(chǎn)生其次級代謝產(chǎn)物丙酮，對肝、腎造成損傷。在早期階段，肝臟損傷可造成肝死亡及肝硬化，腎臟損傷會引起佝僂病及發(fā)育障礙[1]。

應(yīng)用范圍：

1. Ⅰ型酪氨酸血癥HT1的研究

該模型很好模擬了HT1產(chǎn)生的各種癥狀，是研究該病的理想模型。臨床上NTBC雖可替代傳統(tǒng)的肝移植治療高酪氨酸血癥，但是仍存在副作用，而且需要持續(xù)注射來維持療效。到目前為止，還沒有一種治療方案能夠根治HT1。因此，該模型對HT1致病機(jī)理和新型替代治療方案的研究具有很高的臨床價值[2]。

2. 肝相關(guān)疾病藥物研發(fā)

由于Fah基因敲除在早期階段，肝臟損傷可造成肝死亡及肝硬化，腎臟損傷會引起佝僂病及發(fā)育障礙，因此可為此類相關(guān)疾病提供藥物篩選平臺。

3. 肝細(xì)胞移植和再殖肝臟研究

Fah基因敲除可以產(chǎn)生持續(xù)不可逆的肝損傷，抑制肝細(xì)胞增殖，誘發(fā)自身肝細(xì)胞死亡，具有適合移植肝細(xì)胞的生活微環(huán)境，因此被認(rèn)為是評價外源性肝細(xì)胞再殖損傷的理想動物模型。如Fah^－/－IL2rg^－/－缺陷小鼠，存在免疫缺陷（T細(xì)胞和NK細(xì)胞缺失），同樣可進(jìn)行外源干細(xì)胞移植，這為人胎來源的肝原始細(xì)胞的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)[3]。

但是，F(xiàn)ah基因敲除小鼠和豬雖然表型類似于人類的HT1，但是不能準(zhǔn)確模擬人類肝損傷過程，特別是肝纖維化和肝硬化過程。大鼠在體積、親緣性、遺傳特性和疾病發(fā)展機(jī)理方面與人類更加接近，因此建立該大鼠模型具有重大臨床價值[4]。

因為邦耀實驗室本身在肝疾病動物模型方面也有所研究，所以下面分享一些相關(guān)模型。目前我們通過CRISPR-Cas9技術(shù)，獲得了Fah基因缺失小鼠，構(gòu)建Fah大鼠。該大鼠模型Fah基因缺失后，酪氨酸代謝受阻，毒性代謝產(chǎn)物蓄積，引起肝、腎的嚴(yán)重?fù)p傷。并且觀察到小鼠和豬身上沒有的肝纖維化和肝硬化。該模型的最新研究已發(fā)表在《Scientific Reports》上[5]，感興趣的童鞋可以了解一下。

目前邦耀實驗室通過CRISPR-Cas9技術(shù)已成功構(gòu)建Fah基因缺陷的大小鼠，如果您在實驗中有相關(guān)問題和需要，可以隨時與我們溝通聯(lián)系！

Fah^－/－基因敲除大鼠

簡稱：SD –Fah^－/－

基因型：純合子

模型構(gòu)建：在Fah基因的第2號外顯子上敲除10個堿基

模型特點(diǎn)：

1. 具備I型酪氨酸血癥(HT1)典型特征；

2. 不僅觀察到肝功能衰竭，還具有在敲除小鼠和豬模型中看不到的肝纖維化和肝硬化特征；

3. 可以成功移植外源肝細(xì)胞，使大鼠重獲肝臟正常功能。

研究應(yīng)用：

Fah^－/－大鼠存在廣泛而持續(xù)的肝損傷，除了應(yīng)用于Ⅰ型酪氨酸血癥，還可以可用于細(xì)胞移植、肝臟持續(xù)損傷、肝再生、肝癌及肝臟疾病修復(fù)治療的研究中。

1. 大鼠肝臟組織進(jìn)行Anti-Fah免疫組化染色(Fah基因缺失的小鼠無Fah抗體的表達(dá))，表明模型構(gòu)建成功。

     Rat liver(20×,WT)，Rat liver(20×,HZ)，Rat liver(20×,KO)

2. 不給予NTBC治療后Fah^－/－大鼠發(fā)生肝壞死和肝硬化[5]

 

3. Fah^－/－大鼠在肝細(xì)胞移植后提高肝功能和生存期[5]

參考文獻(xiàn)：

[1] R. Berger, G. P. Smit, S. A. Stoker-de Vries, M. Duran, D. Ketting, and S. K. Wadman, 'Deficiency of Fumarylacetoacetase in a Patient with Hereditary Tyrosinemia', Clin Chim Acta, 114 (1981), 37-44.

[2] Mohan, N. et al. Indications and outcome of liver transplantation in tyrosinaemia type 1. European journal of pediatrics 158 Suppl 2,

S49–S54 (1999).

[3] Kuijk, E. W. et al. Generation and characterization of rat liver stem cell lines and their engraftment in a rat model of liver failure. Scientific reports 6, 22154, doi: 10.1038/srep22154 (2016).

[4] Hickey, R. D. et al. Efficient Production of Fah-Null Heterozygote Pigs by Chimeric Adeno-Associated Virus-Mediated Gene Knockout and Somatic Cell Nuclear Transfer. Hepatology 54, 1351–1359, doi: 10.1002/hep.24490 (2011).

[5] Zhang L, Shao Y, Li L, et al. Efficient liver repopulation of transplanted hepatocyte prevents cirrhosis in a rat model of hereditary tyrosinemia type I.[J]. Scientific Reports, 2016.