方案摘要：大腸菌群是一群能發(fā)酵乳糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。本方法使用RAYPA培養(yǎng)基自動(dòng)制備分裝儀，主要圍繞培養(yǎng)基的精準(zhǔn)制備與微生物檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化需求展開。通過(guò)自動(dòng)化技術(shù)確保培養(yǎng)基的成分、滅菌條件和使用流程符合檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，從而提升大腸菌群檢測(cè)的準(zhǔn)確性、效率和重復(fù)性。
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
       多管發(fā)酵法是水中總大腸菌群檢測(cè)的常用方法，其核心原理依托于總大腸菌群的生物學(xué)特性，即能夠發(fā)酵乳糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣，同時(shí)具備革蘭氏染色陰性、無(wú)芽孢且呈桿狀的特點(diǎn)。該檢測(cè)過(guò)程通過(guò)三個(gè)步驟依次開展，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)水樣中總大腸菌群數(shù)量的測(cè)定。‌多管發(fā)酵法需要分裝大量的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液，fluidot自動(dòng)液體分裝儀可以一次性裝四個(gè)試管架，循環(huán)做業(yè)。大大減輕實(shí)驗(yàn)人員的工作壓力，提高實(shí)驗(yàn)效率。
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下:
① 試管。
② 小倒管。
③ 電動(dòng)移液器：pipetty MSIC90-001-10mL。
④ 手動(dòng)移液器：fluidot MSP1K-1ML。
⑤ 恒溫培養(yǎng)箱：36 ℃±1℃。
⑥ 冰箱：2 ℃~8 ℃。
⑦ pH 計(jì)或 pH 比色管或精密 pH 試紙。
⑧ RAYPA培養(yǎng)基自動(dòng)制備分裝儀。
⑨ Fluidot自動(dòng)液體分裝儀。
 
 
2、培養(yǎng)基和試劑
① 乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液。
② 亮綠乳糖膽鹽培養(yǎng)液。
③ 無(wú)菌生理鹽水。
④ 無(wú)菌磷酸鹽緩沖液。
 
三、檢驗(yàn)程序
1、大腸菌群多管發(fā)酵法的檢驗(yàn)程序如下：
 
 
四、實(shí)驗(yàn)步驟
1、使用RAYPA培養(yǎng)基自動(dòng)制備分裝儀，自動(dòng)制備實(shí)驗(yàn)所需的培養(yǎng)液、無(wú)菌水及緩沖液，并按實(shí)驗(yàn)要求分裝到合適的容器內(nèi)。
 
2、初發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 
① 使用Pipetty電動(dòng)移液器吸取 10 mL 水樣接種到 10 mL 雙料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液中，共接種5份。
② 吸取1 mL 水樣接種到 10 mL單料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液中，共接種5份。
③ 吸取1 mL 水樣接種到9mL無(wú)菌生理鹽水或無(wú)菌磷酸鹽緩沖液中，混勻，從中吸取1 mL稀釋液到 10 mL單料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液中，共接種5份。
④ 輕搖試管（避免小倒管中產(chǎn)生氣泡），使液體充分混合，置 36 ℃±1 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h±2 h。觀察每管是否產(chǎn)氣，如有氣體產(chǎn)生則為初發(fā)酵試驗(yàn)陽(yáng)性，如不產(chǎn)氣則為大腸菌群陰性。
 
3、確證實(shí)驗(yàn)
① 初發(fā)酵試驗(yàn)陽(yáng)性管中培養(yǎng)液充分搖勻后，取一接種環(huán)培養(yǎng)液，接種到10 mL亮綠乳糖膽鹽培養(yǎng)液中，置 36 ℃±1 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h±2 h。
② 觀察亮綠乳糖膽鹽培養(yǎng)液中小倒管內(nèi)的產(chǎn)氣情況，如有氣體產(chǎn)生，就可確定為大腸菌群陽(yáng)性，記下產(chǎn)氣的陽(yáng)性試管數(shù)，查表28可得出水樣中大腸菌群的MPN值；如無(wú)氣體產(chǎn)生則為大腸菌群陰性。
4、MPN值的計(jì)算
如水樣含菌量少，可按 100 mL、10 mL、1 mL 接種，實(shí)際 MPN 值應(yīng)為表中的 MPN 值除以 10；如水樣含菌量多，可按1 mL、0.1 mL、0.01 mL接種，實(shí)際 MPN 值應(yīng)為表中的 MPN 值乘以10，以此類推。
5、列舉說(shuō)明
假設(shè)初發(fā)酵試驗(yàn) 15 支試管中的陽(yáng)性管數(shù)如下：
在接種量為 10 mL 的管中有 5 支管陽(yáng)性；
在接種量為1 mL 的管中有 4 支管陽(yáng)性；
在接種量為 0.1 mL的管中有2支管陽(yáng)性；
作為初發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果為 5-4-2。當(dāng)把以上陽(yáng)性管轉(zhuǎn)種到亮綠乳糖膽鹽培養(yǎng)液管里，經(jīng)培養(yǎng)后，若確證試驗(yàn)所給的結(jié)果為 5-3-1，那么査表 28，可得出每 100 mL，水樣中大腸菌群的 MPN 值為 110。接種量為1 mL，0.1 mL，0.01 mL時(shí)，MPN值為1100。
 
五、 結(jié)果與報(bào)告
根據(jù)確證試驗(yàn)證實(shí)的乳糖膽鹽發(fā)酵管反應(yīng)陽(yáng)性管數(shù)，檢索方法對(duì)應(yīng)的MPN表，報(bào)告每100 mL 樣品中大腸菌群的MPN值，以 MPN/100 mL表示。當(dāng)所有接種水樣的乳糖膽鹽發(fā)酵管均為陰性反應(yīng)，可報(bào)告100 mL水樣中未檢出大腸菌群。