SWATH（Sequential Window Acquisition of all THeoretical Mass Spectra）采集模式是蘇黎世聯邦理工學院及AB SCIEX（全球領先的生命科學分析技術公司）的科學家聯合推出的一項基于質譜應用的新技術。利用此項技術，科學家有史以來首次可以獲得單獨蛋白質組學樣品分析中每個肽段的數據。

Q: SWATH技術的原理是什么？

A: SWATH是MS/MSALL技術的擴展，其采集模式是一種新型的MS/MS掃描技術，將掃描范圍劃分為以25Dalton為間隔的一系列區間，通過超高速掃描來獲得掃描范圍內全部離子的所有碎片信息。

Q: SWATH技術有哪些特點？

A：靈敏度高——SWATH技術繼承了MRM的數據采集模式，結合高分辨率的Triple-TOF 5600 plus質譜系統，具有與MRM相當的靈敏度；

可重現性高——重復樣品間的定量相關性可達到0.99以上；

定量準確度高——定量準確度幾乎與MRM技術相當；

線性動態范圍廣——定量范圍可跨越4個數量級；

Q: SWATH技術可以應用于哪些方面？

A: SWATH技術可以用于蛋白質組定量、蛋白復合體的鑒定和宿主蛋白（HCPs）分析。

蛋白質組定量——對細胞、組織或器官中含有的不同時期、不同條件下蛋白表達水平的研究，生物標志物的尋找都需要對蛋白質進行鑒定和定量。SWATH定量方法基于提取Transition峰面積計算出肽段含量，通過肽段含量推理出蛋白質含量的方法。SWATH定量應用到proteome-wide水平就產生了SWATH定量蛋白組，以此方法為基礎可以迅速鎖定幾個樣品間的差異蛋白質。

蛋白復合體的鑒定——在所有細胞功能中，蛋白質間的相互作用是最基本的活動。采用TAP技術將目標靶蛋白的相互作用蛋白特異性富集，然后結合具有高靈敏度、高準確度、高通量等特點的SWATH定量，能夠高特異性的準確富集到靶蛋白的特異性相互作用蛋白，實現復合蛋白質的準確鑒定。

宿主蛋白（HCPs）分析——質譜能夠在快速有效分析HCPs的同時確保更好的準確度，TripleTOF系統搭配SWATH采集模式分析HCPs，可以全面、準確定量分析的同時獲得MSMS信息，一次進樣即可完成任意數量HCPs的定量分析工作，并在30分鐘的LC梯度內，完成ppm級HCPs的含量測定。

Q：iTRAQ、SILAC和SWATH相比呢？

A：iTRAQ定量蛋白質組方法，該方法不依賴樣本，可以做任意樣本的總蛋白質的差異定量，而且定量準確。SILAC是僅僅適合細胞層次的蛋白質組定量，組織的定量需要摸索或者前人已經摸索的模式，中途測試新組織難度較大，細胞層次的SILAC培養費用較高。SWATH是目標蛋白質組相關的定量模式， SWATH可以完成數千種蛋白的定量，準確度極高，通量遠高于MRM，對于亞細胞結構、細菌、真菌、細胞分泌物等樣本，SWATH效果非常好。SWATH本身對物種沒有偏向性，也是目標蛋白定量的一種，定量結果準確，可以和MRM媲美，發文章更具有說服力。

Q：采用SWATH技術對樣品有什么要求？

A：采用SWATH技術，要求樣本物種具有基因組序列、ESTs序列或蛋白質參考序列，適合用于檢測細菌等復雜度較低的樣本，一般樣本蛋白含量至少10ug。

Q：關于“樣品重復”，技術重復和上機重復有什么區別？發表的文章一般要求幾次重復呢？

A： 一般的文章會要求做2~3次實驗重復，僅作1次實驗是有風險的，因為如果是實驗過程出現問題，缺乏結果的評估，往往說服力不夠，對文章發表可能構成影響。

技術重復主要目的是為了驗證試驗流程的穩定性，當三次上級重復的結果一致或者相似時，我們可以判定對樣本的處理過程是穩定的。上機重復的主要目的是驗證儀器的穩定性，當三次上機結果接近或者一致，我們即可判定質譜儀性能是穩定的。當前的上機重復仍然在一些JPR和MCP文章中可見，即沿用了早期的習慣。而應用型的文章中，上機重復或技術重復一般沒有硬性規定，可以不做，如果做了當然最好，Editor就不會再此處找你的問題。

Q：進行SWATHTM數據處理時，建立離子數據庫的最佳方法是什么？

A：現在用于SWATH靶向數據處理的工作流程非常簡單，只需要多肽母離子m/z，主要碎片的m/z和相對豐度，以及保留時間。目前建立離子數據庫主要使用兩種策略：DDA采集數據蛋白鑒定或來源于外部數據庫。在第一種方法中，通過信息依賴采集方法(DDA)對樣品進行數據采集，蛋白通過ProteinPilotTM軟件或其它的搜素引擎進行鑒定，鑒定到的多肽即為用于SWATH數據處理的離子數據庫。選擇1D LCMS 或者2D LCMS技術路線取決于我們研究對象數據庫的復雜度。借助生物信息學方法，還可以對來自于外部數據庫的MSMS數據進行靶向蛋白分析，同時創建離子數據庫，此時需要進行保留時間校正。

Q：通過SWATHTM方法采集數據時，進行保留時間校正的最佳策略是什么？

A：通過SWATHTM軟件進行數據處理時，需要確定一個合理的窄的保留時間窗口，以避免選擇錯誤的色譜峰。現在有兩種策略用于校正實際觀察到的保留時間和數據庫中的保留時間的差異。通過在樣品中增加多肽標準品，用于數據庫構建和SWATH數據采集，或者使用樣品中存在的某些已知的中等/高豐度的多肽作為參考物對保留時間進行校正。