細胞P38α激酶活性光度法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

YIJI細胞P38α激酶活性光度法定量檢測試劑是一種旨在通過多肽底物，在P38α激酶敏感性抑制劑存在與否的情況下，受到P38α磷酸化后，進而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續循環法反應系統，測定產生ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應， 即采用光度法測定其氧化后吸光峰值的變化，以分析細胞裂解樣品中P38α活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或完全純化酶樣品中P38α激酶的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，高度敏感。

技術背景

P38促分裂素原活化蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinases；P38MAPK；EC2.7.11.24），又稱為細胞分裂素特異性結合蛋白（Cytokinin Specific Binding Protein；CSBP），屬于促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）一類中，包括JNK（c-Jun amino terminal kinase）、ERK（細胞外信號相關激酶；extracellular signal related kinase）、P38、Big MAPK1等的一員。酵母的同源基因為Hog1p。在哺乳動物細胞中，促分裂素原活化蛋白激酶通路包含有三大通路，P38信號通路是其中之一。P38MAPK屬于絲氨酸//蘇氨酸（serine/threonine）蛋白激酶家屬。和ERK和JNK通路一起，將細胞外信號轉化為特定細胞反應。P38通路受到各種促炎性刺激（proinflammatory stimuli）例如生長因子、激素、GPCR配體、促炎性細胞因子白介素1和8、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等，以及細胞應激（UV、滲透壓休克osmotic shock、內毒素、熱休克、化學毒素等）而活化，通過MAPK激酶3和6（MKK3和6）、Jun N-terminal kinase kinase1，以及與MAP3k7IP1/TAB1反應，獲得磷酸化后，由胞漿轉移到胞核，進而激活下游MK2、MK3、PARK、Mac、MSK、MNK1、轉錄因子（STAT1、NFAT、ATF2、MEF2C、P53、CHOP、MAX、CDC25B）、MnSOD等，達到調節促炎性細胞因子的轉譯、各種細胞外刺激的基因表達、細胞周期、分化、凋亡的調節、TNFα、IL1、COX2的生物合成等功能。P38通路異常，將導致風濕性關節炎、炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)、銀屑�。╬soriasis）和癌癥等，由此P38成為藥物靶標。P38 MAPK蛋白激酶有5個亞酶，包括α（MAPK14/SAPK2A）、β（MAPK11）、γ（MAPK12/ERK6/SAPK3）、δ（MAPK13/SAPK4）、P38-2。其中P38α為廣譜表達，由MAP激酶激酶（MKK）激活以及MAP3K7IP/TAB1蛋白反應后激活，其作用底物為ATF2、MEF2C、MAX、CDC2B、P53等，與細胞繁殖、分化、細胞周期、轉錄調節、炎性反應、細胞因子合成、發育（紅細胞、胎盤）等有關；P38β為廣譜表達，主要由MAP激酶激酶6（MKK6）激活，其作用底物為ATF2/CREB2；P38γ主要在骨骼肌組織表達，是成肌細胞（myoblast）分化為肌管（myotube）的信號傳導者；P38δ在肺、胰腺、腎、小腸、睪丸等組織高表達，主要由MAP激酶激酶3和6（MKK3和6）激活，其作用底物為ATF2、Tau、Stathmin、eEF2K等，與角質形成細胞（keratinocyte）分化有關。P38α磷酸化目標序列為IPTTPITTTYFFFKKK。基于底物IPTTPITTTYFFFKKK，在P38α敏感性抑制劑SD169的存在與否的情況下，受到P38a激酶的磷酸化，獲得產物磷酸化多肽，進而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應系統中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來定量分析P38a激酶的活性。其反應方式為：

產品內容

YIJI清理液（Reagent A）  毫升

YIJI裂解液（Reagent B）  毫升

YIJI緩沖液（Reagent C）  毫升

YIJI酶促液（Reagent D）  微升

YIJI反應液（Reagent E）  微升

YIJI底物液（Reagent F）  微升

YIJI陰性液（Reagent G）  微升

YIJI專性液（Reagent H）  微升

產品說明書     1份

保存方式

保存YIJI清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴格避免光照和反復凍融；有效保證6月

用戶自備

P38α激酶：用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離

（微型）臺式離心機：用于樣品預處理

比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器

分光光度儀或酶標儀：用于樣品光度分析

實驗步驟

• 待測樣品準備
• 準備好75cm²細胞培養瓶或100mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁷細胞）
• 小心加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：避免使用胰酶消化）
• 加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升YIJI裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用YIJI Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

• 測定準備
• 準備好待測樣品（例如細胞裂解懸液等），置于冰槽里 
• 設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔1分鐘，讀數6次（共5分鐘），并置零
• YIJI緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

• 背景對照測定

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI反應液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 放進30℃培養箱里靜置3分鐘
• 加入xx微升YIJI陰性液（Reagent G）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數5分鐘 

• 樣品總活性測定

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI反應液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 放進30℃培養箱里靜置3分鐘
• 加入5微升待測樣品（注意：50微克細胞裂解蛋白；樣品須溶解）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數5分鐘 

• 樣品非特異活性測定

檢測開始前，移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到1.5毫升離心管，分別加入xx微升YIJI專性液（Reagent H）和待測樣品（注意：50微克細胞裂解蛋白），混勻后，放進30℃培養箱里孵育30分鐘。然后繼續下列操作。

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI反應液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F） 
• 放進30℃培養箱里靜置3分鐘
• 加入20微升上述預處理的待測樣品
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數5分鐘

• 計算樣品活性

• 樣品總活性和非特異活性計算

2）樣品特異活性計算

七、酶標儀測定

• 樣品總活性測定

• 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品
• 分別移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到96孔板里
• 分別加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 分別加入xx微升YIJI反應液（Reagent E）
• 分別加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 輕輕搖動96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入xx微升YIJI陰性液（Reagent G）或待測樣品（50微克細胞裂解懸液蛋白）到相應孔里（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數和5分鐘讀數
• 活性計算：

• 樣品非特異活性測定

檢測開始前，移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到1.5毫升離心管，分別加入xx微升YIJI專性液（Reagent H）和待測樣品（注意：50微克細胞裂解蛋白），混勻后，放進30℃培養箱里孵育30分鐘。然后繼續下列操作。

• 在96孔板上做好相應標記：待測樣品
• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到96孔板里
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI反應液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F） 
• 輕輕搖動96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升上述預處理的待測樣品
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數和5分鐘讀數
• 活性計算：

• 樣品特異活性計算

八、抑制劑篩選

• 在96孔板上做好相應標記：背景、完全活性和待測抑制劑樣品
• 按下表加入試劑，進行樣品預處理

• 分別移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里
• 分別加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 分別加入xx微升YIJI反應液（Reagent E）
• 分別加入xx微升YIJI底物液（Reagent F） 
• 輕輕搖動96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升上述預處理的待測樣品
• 即刻放進30℃酶標儀檢測：測讀30分鐘
• 抑制活性計算：

注意事項

• 本產品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液
• 樣品須澄清，至關重要 
• 如果出現明顯的干擾現象，建議使用樣本背景對照去除任何內源性干擾因子
• 加入樣品啟動反應后3秒內即刻光度測定
• 測定值由高到低變化；測定可持續30分鐘
• 光度測定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測定0分鐘讀數高于5分鐘讀數表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供 YIJI Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 可以使用P38α抑制劑（VX745；IC50=10納摩爾）作為抑制劑對照或陰性對照
• P38α激酶活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.6條件下，每分鐘內能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列蛋白激酶檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感