結直腸癌（CRC）是第三大最常見的癌癥，全球癌癥死亡率第二。晚期CRC轉移患者的預后較差，耐藥性嚴重。因此，尋找與CRC發(fā)病機制相關的新基因對開發(fā)有效的CRC治療方法至關重要。越來越多的研究表明，脂質代謝異常是CRC等癌癥的標志性特征，然而，參與CRC脂質代謝依賴的分子機制仍知之甚少。角鯊烯環(huán)氧化酶(Squalene epoxidase, SQLE)是膽固醇生物合成中的限速酶，有研究表明SQLE在CRC中過表達，但SQLE在CRC進展中的潛在作用仍存在爭議。香港中文大學的于君研究團隊通過對配對的CRC和癌旁組織樣本采用mRNA和蛋白表達分析，SQLE轉基因（Sqle tg）小鼠糞便樣本進行宏基因組學和代謝組學分析共同揭示了SQLE在CRC中的作用，相關研究成果發(fā)表于《Gut》。

1. SQLE在CRC中過表達且與CRC預后不良相關

對三個獨立的CRC隊列（香港隊列、TCGA 和 GDS4382）中SQLE的mRNA和蛋白表達進行分析，發(fā)現在原發(fā)性CRC組織中SQLE的 mRNA和蛋白的表達均高于對照癌旁組織。使用Kaplan-Meier曲線和多變量Cox比例風險回歸分析評估SQLE對CRC患者預后的影響，結果顯示SQLE mRNA的高表達與CRC患者差的預后相關，是CRC疾病特異性預后不良的獨立因素。進一步借助免疫組化對207例CRC患者進行TMA分析也證實了SQLE能在蛋白水平上預測患者的預后（圖1）。可見SQLE mRNA和蛋白表達是預測CRC患者生存不良的獨立預后因素。

圖1. SQLE在CRC中表達上調預示著較差的生存

2. SQLE過表達促進CRC發(fā)生

在體外細胞水平上證實了SQLE通過抑制細胞凋亡和激活細胞周期進程來促進CRC細胞生長后，進一步在體內動物水平上以Rosa26-Sqle tg小鼠與Cdx2-Cre^ERT2小鼠雜交構建結腸特異性Sqle tg小鼠來探究SQLE在體內CRC發(fā)生中的相關性。與野生型小鼠相比，Sqle tg小鼠的腫瘤發(fā)生率、腫瘤數量和腫瘤負荷均顯著增加，Sqle tg結腸內CRC形成，伴有結腸異型增生和高度異型增生的小鼠比例增加。同時Sqle tg小鼠在CRC中的致癌功能可以通過細胞增殖增加的Ki-67評分和細胞凋亡減少的TUNEL評分來證明。通過對小鼠的結腸組織進行癌癥通路PCR分析，觀察到細胞增殖標志物Mki67、Ccnd2和E2f4表達上調，而促凋亡基因Casp9和Casp2表達下調，從而證明Sqle在CRC腫瘤發(fā)生中促進細胞增殖和抑制細胞凋亡的作用。在CRISPR/Cas9的全身Sqle KO小鼠上構建AOM-DSS化學致癌模型，與野生型相比，Sqle KO小鼠結腸腫瘤數量減少，再次證明Sqle在體內結直腸腫瘤發(fā)生中的致癌功能（圖2）。

圖2. 結腸特異性Sqle tg小鼠促進結直腸腫瘤發(fā)生

3. SQLE促進膽固醇從頭生物合成

SQLE是膽固醇生物合成的第二限速酶，在LOVO和SW1116細胞中，SQLE過表達增加了膽固醇生物合成基因（HMGCS1、HMGCR、MVK、PMVK、MVD、IDI1、FDPS和FDFT1）的mRNA表達，蛋白印跡分析發(fā)現過表達SQLE的細胞或Sqle tg小鼠的 HMGCR、FDFT1和FDPS 蛋白水平升高，而 SQLE敲低或Sqle^+/−小鼠相應基因的蛋白水平下調，提示SQLE能促進膽固醇從頭生物合成，進而促進CRC細胞增殖（圖3，圖4）。

圖3. SQLE過表達促進膽固醇生物合成基因表達

圖4. SQLE敲低抑制膽固醇合成途徑基因表達

4．Sqle tg小鼠腸道菌群失調及代謝組改變

腸道菌群失調是CRC發(fā)生的新致病因素，作者對Sqle tg和野生型小鼠糞便進行鳥槍宏基因組分析，Sqle tg小鼠的α多樣性指數呈下降趨勢，并測定Sqle tg和野生型小鼠的細菌組成變化，觀察到Sqle tg小鼠中Desulfovibrio fairfieldensis, Rhodococcus erythropolis, Brucella abortus和Chlamydia muridarum等致病菌顯著富集，而保護性細菌如Streptomyces violaceusniger和Pseudomonas sp Leaf58減少，經qPCR驗證這些關鍵菌種類的變化，表明體內SQLE過表達促進腸道菌群失調。

已知富集的致病菌具有多種代謝活性，對小鼠糞便進行非靶向代謝組學分析，結果與野生型小鼠相比，Sqle tg小鼠糞便富含次級膽汁酸如石膽酸、鵝去氧膽酸、牛磺去氧膽酸、去氧膽酸，并經靶向代謝組學證實Sqle tg小鼠次級膽汁酸如石膽酸、異石膽酸、異別石膽酸和去氧膽酸的升高。次級膽汁酸是在腸道菌群的作用下由初級膽汁酸轉化生成的，對Sqle tg小鼠腸道菌群和代謝物進行相關性分析，發(fā)現次級膽汁酸和致病菌C. muridarum顯著相關，提示C. muridarum可能參與促進次級膽汁酸的增加。此外，發(fā)現四種病原菌均與代謝物改變呈正相關，表明Sqle tg表達在小鼠CRC進展中調節(jié)腸道微生物組和代謝物（圖5）。

圖5. 結腸特異性Sqle tg小鼠腸道菌群和代謝物改變

5．SQLE過表達損害腸道屏障功能

次級膽汁酸作為一種內毒素，其水平升高是CRC的重要風險因素，它對結腸上皮細胞有毒性，破壞腸道屏障功能，而腸道菌群失調也與腸道屏障受損密切相關，因此，SQLE過表達誘導的腸道菌群失調可能會導致腸屏障功能障礙。通過對Sqle tg和野生型小鼠腸道屏障功能進行FITC-葡聚糖跨上皮通透性分析，發(fā)現Sqle tg小鼠血清FITC-葡聚糖水平更高，電子顯微鏡（EM）也觀察到Sqle tg小鼠緊密連接的破壞。上皮緊密連接是由細胞連接蛋白維持的，蛋白質印跡分析發(fā)現Sqle tg小鼠結腸中的細胞連接蛋白Jam-c和occludin下調。此外，Sqle tg小鼠內粘液關鍵成分MUC2的mRNA水平也下調。腸漏誘導促炎反應，Sqle tg小鼠結腸組織炎癥通路的PCR陣列分析顯示CxCl3、CRP和CXCR2等促炎因子顯著上調。綜上，腸道菌群失調-代謝物軸可能導致 Sqle tg小鼠腸道屏障功能障礙。

進一步收集AOM模型的Sqle tg和野生型小鼠的糞便移植到無菌(GF)小鼠體內，以探究Sqle tg表達誘導的腸道菌群失調是否能影響結腸細胞增殖。在處死小鼠前進行FITC葡聚糖跨上皮通透性分析，發(fā)現Sqle tg小鼠糞便進行灌胃的GF小鼠血清中FITC-葡聚糖水平高于野生型小鼠糞便灌胃的GF小鼠，并經EM 證實腸道屏障破壞。同理與移植野生型糞便相比，移植Sqle tg小鼠糞便的GF小鼠細胞連接蛋白Jam-c和occludin表達下調，同時Ki-67染色表明其顯著促進結腸上皮細胞增殖。總之，SQLE誘導的腸道菌群失調使腸道屏障功能受損進而促進結腸細胞生長（圖6）。

圖6. 腸道菌群-代謝物軸介導Sqle tg FMT小鼠腸屏障功能障礙

6. 藥物抑制SQLE提高CRC的化療效果

使用SQLE抑制劑特比奈芬處理HT29和DLD1細胞，發(fā)現特比奈芬在體外劑量依賴性抑制HT29和DLD1細胞生長。此外，特比奈芬也顯著抑制原發(fā)性CRC類器官的生長。接著評估CRC常用化療藥特比奈芬與奧沙利鉑或5-FU聯合用藥效果，發(fā)現特比奈芬使HT29和DLD1細胞對奧沙利鉑和5-FU的生長抑制更敏感，聯合指數(CI)定量評估表明特比奈芬與奧沙利鉑或5-FU的聯合用藥具有協同作用，在體外協同誘導細胞凋亡。進一步建立裸鼠皮下移植瘤模型，將1106個HT29細胞植入裸鼠背側，分為六組：（1）載體；(2)特比萘芬；(3) 5-FU；(4) 奧沙利鉑；(5) 特比萘芬+5-FU 和(6) 特比萘芬+奧沙利鉑。結果表明，單藥治療可抑制約50%的腫瘤生長，且與載體相比，特比奈芬+5-FU和特比奈芬+奧沙利鉑用藥均可使腫瘤完全停止生長，效果明顯優(yōu)于單藥治療。在CRC治療中SQLE可作為治療靶點，抑制SQLE可以提高CRC化療效果。

圖7. SQLE是CRC的治療靶點

小結

本研究通過細胞系、結腸特異性Sqle tg小鼠和Sqle KO小鼠模型建立了SQLE作為CRC的致瘤因子，明確了SQLE在CRC中的致癌作用，SQLE可以促進CRC細胞增殖和存活，并通過引起腸道菌群失調、代謝物改變、腸屏障功能障礙進而影響腸道腫瘤微環(huán)境。特比萘芬對SQLE的阻斷作用對CRC細胞具有生長抑制作用，因此特比奈芬聯合5-FU或奧沙利鉑可以顯著提高治療效果，提示其在CRC治療中的臨床應用潛力。

參考文獻

Squalene epoxidase drives cancer cell proliferation and promotes gut dysbiosis to accelerate colorectal carcinogenesis. Gut. 2022. 

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