編者按

在單細胞空間多組學(xué)時代，盡管新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，單細胞轉(zhuǎn)錄組測序仍然是揭示復(fù)雜疾病分子機制的強大工具，是找尋疾病靶點的關(guān)鍵手段之一。本文將介紹一篇今年發(fā)表的關(guān)于原發(fā)性膽汁性膽管炎的單細胞轉(zhuǎn)錄組研究文獻，通過詳細解析該研究的設(shè)計思路和方法，帶大家領(lǐng)略如何利用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)表高分文獻。

研究背景

原發(fā)性膽汁性膽管炎（PBC）是一種以多系免疫失調(diào)為特征的慢性自身免疫性肝病，可導(dǎo)致肝臟炎癥、纖維化甚至肝硬化。由于傳統(tǒng)檢測方法的局限性，PBC的局部肝臟免疫發(fā)病機制尚未完全闡明。

文章詳情

文章題目：Single-cell RNA sequencing reveals the pro-inflammatory roles of liver-resident Th1-like cells in primary biliary cholangitis
中文題目：單細胞RNA測序揭示肝臟駐留Th1樣細胞在原發(fā)性膽汁性膽管炎中的促炎作用
發(fā)表時間：2024.10
期刊名稱：Nature Communications
影響因子：14.7
實驗平臺：10X Genomics單細胞轉(zhuǎn)錄組測序
DOI：10.1038/s41467-024-53104-9

技術(shù)路線

為了方便各位老師快速掌握研究思路，小編繪制了文章的研究框架圖，供各位觀賞：

研究結(jié)果

1.PBC患者肝臟和PBMC的單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

為了闡明PBC患者的浸潤型免疫細胞特性，對5名未接受熊去氧膽酸（UDCA）治療且處于Nakanuma分期I~II期的PBC患者、5名肝血管瘤患者（肝臟健康對照組）以及5名健康供者（PBMC健康對照組）的肝臟組織和外周血單核細胞（PBMC）進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序和細胞注釋。與對照組相比，PBC中免疫細胞亞群分布的變化在肝臟和PBMC之間并未表現(xiàn)出一致的模式。細胞因子評分和炎癥評分結(jié)果表明，PBC患者的肝臟顯示出增強的炎癥反應(yīng)，而在外周血中則沒有這種現(xiàn)象。因此，我們將研究重點放在探索PBC中肝細胞的病理特征上。

Fig.1 PBC 患者肝臟和 PBMC 的單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

2.膽管細胞和肝星狀細胞在PBC中表現(xiàn)出炎癥和基質(zhì)重塑基因表達增加

對肝臟中的非免疫細胞重新聚類，發(fā)現(xiàn)了一簇主要來源于PBC組的活化星狀細胞，可能在促進細胞外基質(zhì)重塑并最終導(dǎo)致PBC肝纖維化的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在PBC患者的膽管細胞中，與膽管細胞生理功能相關(guān)的多個通路下調(diào)，炎癥相關(guān)基因及通路上調(diào)和激活，暗示膽管細胞可能進入衰老狀態(tài)并參與了膽管的炎癥反應(yīng)。細胞通訊分析和免疫熒光染色實驗發(fā)現(xiàn)，在炎癥微環(huán)境中，高表達CCR7的初始T細胞和B細胞可能被星狀細胞直接招募到局部炎癥區(qū)域，并分別分化為輔助T細胞和漿細胞。衰老的膽管細胞和活化的星狀細胞在放大炎癥信號和促進PBC肝纖維化的過程中發(fā)揮了不可或缺的作用。

Fig.2 PBC患者肝臟非免疫細胞的特點

3. PBC肝臟的庫普弗細胞清除功能降低，炎癥功能增強

在髓系細胞中，CD14+單核細胞的比例減少，而肝臟駐留的庫普弗細胞比例增加。盡管PBC患者肝臟中的單核細胞數(shù)量減少，但庫普弗細胞的細胞因子評分以及促炎基因如IL1B和CXCL2的表達卻增加，同時TNF也顯示出上升趨勢。庫普弗細胞中清道夫功能相關(guān)基因表達下調(diào)，說明庫普弗細胞增強的促炎作用可能加劇肝臟局部的炎癥反應(yīng)，而其清道夫功能的抑制可能減緩衰老膽管細胞和活化星狀細胞的清除過程。

Fig.3 PBC患者肝髓系細胞的特征

4. PBC患者肝內(nèi)T細胞表現(xiàn)出增強的促炎功能和降低的細胞毒性

PBC組中的調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）比例增加，與對照組比較發(fā)現(xiàn)，促免疫與抑制免疫的功能基因均被激活，說明PBC患者的Treg細胞處于異常激活狀態(tài)。具有強烈促炎特性的Th1樣細胞比例顯著增加，CX3CR1+CD8+T細胞和CX3CR1+NK細胞的細胞毒性功能受到抑制。細胞毒性功能受損可能會阻礙衰老膽管細胞和活化星狀細胞的清除，從而加劇疾病的發(fā)展。細胞通訊分析發(fā)現(xiàn)經(jīng)典樹突狀細胞（cDCs）可能通過激活Th1樣細胞而在PBC的發(fā)展中扮演不可或缺的角色。總體而言，Th1樣細胞在PBC中發(fā)揮了主導(dǎo)性的促炎作用。

Fig.4 PBC 患者肝臟T細胞的特征

5. 促炎性Th1樣細胞僅限于肝臟組織，并與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)

Th1樣細胞表達了與組織駐留相關(guān)的基因，而幾乎不表達與T細胞歸巢相關(guān)的基因，表明其具有組織駐留特征。對PBC患者肝臟進行免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，組織駐留的Th1樣細胞參與了PBC的發(fā)展，并促進了肝組織的炎癥和纖維化進程。轉(zhuǎn)錄因子分析（SCENIC）發(fā)現(xiàn)在Th1樣細胞中最特異性激活的轉(zhuǎn)錄因子在PBC組中進一步增強，包括RUNX1和STAT1，這表明RUNX1和STAT1的激活可能在Th1樣細胞效應(yīng)功能中發(fā)揮重要作用。

Fig.5 PBC患者肝臟駐留Th1樣細胞的特征

6. 促炎性Th1樣細胞在PBC小鼠肝臟中擴增

用2-辛.炔酸與牛血清白蛋白（2OA-BSA）偶聯(lián)物免疫的PBC小鼠會出現(xiàn)典型的門靜脈CD4+和CD8+T細胞浸潤表型。對這種模型和對照小鼠肝臟組織進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)模型組中髓系細胞和T細胞的比例增加，而非免疫細胞如膽管細胞和內(nèi)皮細胞的比例減少，并且膽管細胞和星狀細胞可能被TNF、IL1B和IFNG等促炎因子激活，并產(chǎn)生多種趨化因子以招募免疫細胞來放大炎癥信號。高表達Ifng的Th1樣細胞群體有增加的趨勢，并具有組織駐留特性，與人肝臟中的Th1樣細胞有相似的轉(zhuǎn)錄調(diào)控特征。流式細胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)具有組織駐留表面分子特征的CD4+T細胞在疾病模型小鼠的肝臟中擴增。這些細胞通過分泌IFNγ表現(xiàn)出獨特的Th1樣特性和促炎能力，并參與了膽管炎發(fā)展，可能與先前報道的組織駐留記憶T細胞有所重疊。

Fig.6 PBC小鼠肝臟中Th1樣細胞的鑒定和特征

7. 阻斷JAK/STAT通路可減輕PBC小鼠的膽管損傷并改善肝臟駐留的Th1樣細胞

研究者發(fā)現(xiàn)JAK/STAT通路可能參與疾病發(fā)展，因此假設(shè)巴瑞替尼（一種已被批準(zhǔn)用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的JAK1/JAK2抑制劑）可能阻斷由Th1樣細胞引起的免疫紊亂。對PBC小鼠治療2周后發(fā)現(xiàn)，門靜脈區(qū)域的炎癥細胞浸潤明顯減少，膽管細胞壞死也有所緩解。該藥物顯著抑制了T細胞的擴張，局部IFNγ和TNFα蛋白水平也顯著降低。與未治療組比較T細胞比例差異發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)炎癥的緩解與IFNγ分泌的Th1樣細胞數(shù)量減少相關(guān)，這種治療效果更可能是由CD69+肝駐留細胞群提供的。這些結(jié)果表明，巴瑞替尼能夠緩解由2OA-BSA免疫的小鼠膽管炎模型中的癥狀。

Fig.7 巴瑞替尼對PBC小鼠膽管炎的影響

主要結(jié)論

本研究利用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)解析了PBC患者的分子機制，揭示了膽管細胞和肝星狀細胞參與了肝臟炎癥和纖維化的過程。此外，庫普弗細胞顯示出促炎因子水平的增加和吞噬功能相關(guān)基因表達的減少，而T細胞則表現(xiàn)出促炎因子水平的增強以及細胞毒性相關(guān)基因表達的降低。有趣的是，在PBC患者和PBC小鼠模型的肝臟中識別出一個具有JAK-STAT激活的肝臟駐留Th1樣細胞群體。阻斷JAK-STAT通路可以緩解肝臟炎癥并在PBC小鼠模型中消除肝臟駐留的Th1樣細胞。這些結(jié)果擴展了對PBC病理機制的理解，并為PBC患者的治療提供了潛在靶點。

參考文獻

Jin, Ciliang et al. “Single-cell RNA sequencing reveals the pro-inflammatory roles of liver-resident Th1-like cells in primary biliary cholangitis.” Nature communications vol. 15,1 8690. 7 Oct. 2024.