LER現(xiàn)象揭秘之細菌內(nèi)毒素檢測中的假陰性風險與應對措施
自2013年以來，“低內(nèi)毒素回收”（LER）現(xiàn)象在細菌內(nèi)毒素檢測領域引起了廣泛關注。LER描述了在含有螯合緩沖液和聚山梨醇酯的未稀釋單克隆抗體制劑中，觀察到的鱟試劑（LAL）檢測干擾（抑制）。這一現(xiàn)象引發(fā)了關于病患者安全和藥典細菌內(nèi)毒素測試在檢測生物制品中低水平內(nèi)毒素污染有效性方面的廣泛討論。
一、內(nèi)毒素與LPS的基本概念
在討論LER現(xiàn)象時，首先需要明確“內(nèi)毒素”和“脂多糖”（LPS）的概念。
內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細菌外細胞膜的成分，而LPS是內(nèi)毒素復合物的特定成分，包括脂質(zhì)A部分，它會引起哺乳動物的致熱反應，并在LAL測試中引發(fā)信號產(chǎn)生。LPS是一種兩親性分子，其疏水部分（脂質(zhì)A）嵌入細胞膜，親水部分（O抗原）暴露于細胞外環(huán)境。
二、LER現(xiàn)象的生化與物理基礎
美國藥典（USP）內(nèi)毒素參考標準品（RSE）和目前與LAL檢測試劑盒相關的所有市售內(nèi)毒素控制標準品（CSE）都是從各種大腸桿菌菌株中提取和純化的“裸”LPS制劑。
在LAL試驗中，RSE和CSE的劇烈混合是為了確保溶解材料的適當再懸浮，防止LPS吸附在容器表面，并優(yōu)化LPS的聚集狀態(tài)以進行試驗。然而，在LER制劑中，螯合劑和聚山梨醇酯會導致LPS聚集體變小，甚至接近單體狀態(tài)，進而降低其生物活性，出現(xiàn)LER現(xiàn)象。
三、LER現(xiàn)象對患者安全與藥典測試的影響
LER現(xiàn)象可能導致LAL檢測出現(xiàn)假陰性結(jié)果，從而對患者安全構(gòu)成隱患。然而，經(jīng)過改進的工藝控制加上有效的LAL檢測，在工藝過程和釋放檢測中都很好地保證了這些生物制劑的供應安全。
此外，歐盟委員會（EC）和美國藥典（USP）的專家委員會也對LER現(xiàn)象進行了深入研究，并認為當前的藥典測試方法對于檢測生物制品中的內(nèi)毒素污染是有效的。
四、LER現(xiàn)象的實驗研究與數(shù)據(jù)支持
多項實驗研究表明，LER現(xiàn)象并不是LAL測試有效性的問題，而是用作對照的加標分析物的選擇以及保持時間研究的實驗設計的問題。
例如，在一項LER制劑保持時間研究中，同時進行了兔子熱原測試（RPT）和LAL檢測，并使用內(nèi)毒素參考標準品（RSE）和各種實驗室衍生的囊泡制劑（如陰溝腸桿菌、皮氏羅爾斯頓氏菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和粘質(zhì)沙雷氏菌）作為加標分析物。在研究開始時（T=0），所有加標制劑在RPT中產(chǎn)生類似熱原反應，且在LAL試驗中完全檢測到。在保持24小時后，囊泡制劑在RPT中仍有反應，LAL檢測回收正常；但RSE在兔熱原試驗和LAL檢測中均無反應，顯示了LER現(xiàn)象的存在。
此外，已發(fā)表的數(shù)據(jù)也表明，在適當?shù)膶嶒灄l件下，使用天然內(nèi)毒素囊泡作為分析物可以克服用RSE或CSE觀察到的LER效應。
五、總結(jié)
LER現(xiàn)象揭示了LPS和內(nèi)毒素雖然在化學、結(jié)構(gòu)和物理上存在差異，但都可能引起相似的反應。因此，在使用“內(nèi)毒素”一詞時，必須明確其含義。此外，針對LER現(xiàn)象的研究也促使USP提出了一種由天然內(nèi)毒素組成的新型“天然內(nèi)毒素”（NOE）標準制劑，以更好地模擬天然內(nèi)毒素污染的情況，并進一步提高LAL檢測的準確性。
LER現(xiàn)象是一個復雜的問題，涉及多個方面的因素。然而，經(jīng)過深入研究和實踐驗證，當前的LAL檢測方法在檢測生物制品中的內(nèi)毒素污染方面仍然是有效的。未來，隨著對LER現(xiàn)象和NOE標準制劑的進一步研究，我們將有望進一步提高內(nèi)毒素檢測的準確性和可靠性。
一、內(nèi)毒素與LPS的基本概念
在討論LER現(xiàn)象時，首先需要明確“內(nèi)毒素”和“脂多糖”（LPS）的概念。
內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細菌外細胞膜的成分，而LPS是內(nèi)毒素復合物的特定成分，包括脂質(zhì)A部分，它會引起哺乳動物的致熱反應，并在LAL測試中引發(fā)信號產(chǎn)生。LPS是一種兩親性分子，其疏水部分（脂質(zhì)A）嵌入細胞膜，親水部分（O抗原）暴露于細胞外環(huán)境。
二、LER現(xiàn)象的生化與物理基礎
美國藥典（USP）內(nèi)毒素參考標準品（RSE）和目前與LAL檢測試劑盒相關的所有市售內(nèi)毒素控制標準品（CSE）都是從各種大腸桿菌菌株中提取和純化的“裸”LPS制劑。
在LAL試驗中，RSE和CSE的劇烈混合是為了確保溶解材料的適當再懸浮，防止LPS吸附在容器表面，并優(yōu)化LPS的聚集狀態(tài)以進行試驗。然而，在LER制劑中，螯合劑和聚山梨醇酯會導致LPS聚集體變小，甚至接近單體狀態(tài)，進而降低其生物活性，出現(xiàn)LER現(xiàn)象。
三、LER現(xiàn)象對患者安全與藥典測試的影響
LER現(xiàn)象可能導致LAL檢測出現(xiàn)假陰性結(jié)果，從而對患者安全構(gòu)成隱患。然而，經(jīng)過改進的工藝控制加上有效的LAL檢測，在工藝過程和釋放檢測中都很好地保證了這些生物制劑的供應安全。
此外，歐盟委員會（EC）和美國藥典（USP）的專家委員會也對LER現(xiàn)象進行了深入研究，并認為當前的藥典測試方法對于檢測生物制品中的內(nèi)毒素污染是有效的。
四、LER現(xiàn)象的實驗研究與數(shù)據(jù)支持
多項實驗研究表明，LER現(xiàn)象并不是LAL測試有效性的問題，而是用作對照的加標分析物的選擇以及保持時間研究的實驗設計的問題。
例如，在一項LER制劑保持時間研究中，同時進行了兔子熱原測試（RPT）和LAL檢測，并使用內(nèi)毒素參考標準品（RSE）和各種實驗室衍生的囊泡制劑（如陰溝腸桿菌、皮氏羅爾斯頓氏菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和粘質(zhì)沙雷氏菌）作為加標分析物。在研究開始時（T=0），所有加標制劑在RPT中產(chǎn)生類似熱原反應，且在LAL試驗中完全檢測到。在保持24小時后，囊泡制劑在RPT中仍有反應，LAL檢測回收正常；但RSE在兔熱原試驗和LAL檢測中均無反應，顯示了LER現(xiàn)象的存在。
此外，已發(fā)表的數(shù)據(jù)也表明，在適當?shù)膶嶒灄l件下，使用天然內(nèi)毒素囊泡作為分析物可以克服用RSE或CSE觀察到的LER效應。
五、總結(jié)
LER現(xiàn)象揭示了LPS和內(nèi)毒素雖然在化學、結(jié)構(gòu)和物理上存在差異，但都可能引起相似的反應。因此，在使用“內(nèi)毒素”一詞時，必須明確其含義。此外，針對LER現(xiàn)象的研究也促使USP提出了一種由天然內(nèi)毒素組成的新型“天然內(nèi)毒素”（NOE）標準制劑，以更好地模擬天然內(nèi)毒素污染的情況，并進一步提高LAL檢測的準確性。
LER現(xiàn)象是一個復雜的問題，涉及多個方面的因素。然而，經(jīng)過深入研究和實踐驗證，當前的LAL檢測方法在檢測生物制品中的內(nèi)毒素污染方面仍然是有效的。未來，隨著對LER現(xiàn)象和NOE標準制劑的進一步研究，我們將有望進一步提高內(nèi)毒素檢測的準確性和可靠性。
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